雷帕霉素和紫杉醇對骨髓內皮祖細胞數量及功能的影響

朱琳琳 陳紹良 張娟 劉志忠

（南京醫科大學附屬南京第一醫院心內科，江蘇 南京 210006）

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內皮的前體細胞，存在于成年機體的骨髓及外周血中，在成體血管新生中起重要作用。雷帕霉素是一種大環內酯類抗生素，具有抗真菌、免疫抑制以及抗腫瘤作用。紫杉醇是一種抗增殖藥物，具有抗腫瘤作用。在冠狀動脈介入治療術中應用雷帕霉素或紫杉醇藥物洗脫支架，可顯著降低支架內再狹窄的發生率。本研究旨在探討雷帕霉素和紫杉醇對體外培養的大鼠骨髓來源的EPCs的數量及其增殖能力、遷移能力和黏附能力的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 體質量為100 g左右的雄性SD（Sprague Dawley）大鼠10只，由南京醫科大學動物實驗中心提供。異硫氰酸熒光素標記的單葉豆凝集素1（FITC－BS－1 lectin）、雷帕霉素和紫杉醇購自SIGMA公司；DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI－acLDL）購自 Molecular Probes公司。細胞培養液為DMEM（購自GIBCO公司），含10%胎牛血清（購自Hyclone公司）。

1.2 EPCs的分離和培養 將SD大鼠斷頸處死，置于70%乙醇中20～30 min，無菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，去除附著于骨的軟組織和骨骺端。將分離的股骨和脛骨移入無菌平皿，用5 mL磷酸緩沖液（PBS）將骨髓沖出，用200目濾網過濾骨髓并以2000 r／min離心5 min。將沉淀細胞重懸于10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液中，以2×106／孔接種于明膠包被的24孔培養板上，置于細胞培養箱中培養。接種后4 d用PBS沖洗去掉未貼壁細胞，更換培養液培養至7 d，再次用PBS沖洗去掉未貼壁細胞，得到貼壁細胞供后續實驗用。

1.3 細胞染色及鑒定 將貼壁細胞隨機分為7組：A 組：雷 帕 霉 素 5.0μg／mL；B 組：雷 帕 霉 素1.0μg／mL；C組：雷帕霉素0.1μg／mL；D組：紫杉醇5.0μg／mL；E組：紫杉醇1.0μg／mL；F組：紫杉醇0.1μg／mL；G組：對照組，加入溶劑二甲基亞砜（DMSO）。各組細胞在含相應濃度藥物的10%胎牛血清的DMEM培養液中培養24 h。對貼壁細胞進行 DiI－acLDL和 FITC－BS－1 Lectin雙標記，將染色雙陽性者認定為EPCs。具體方法：細胞與DiI－acLDL（2.4μg／mL）在37℃下孵育1 h，觀察EPCs對DiI－acLDL的攝取。然后以2%多聚甲醛固定細胞10 min，固定后用PBS浸洗，將FITC－BS－1 Lectin（10μg／mL）加于上述標本中，在37℃下孵育1 h后用激光共聚焦顯微鏡鑒定，雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs。采用倒置熒光顯微鏡進行計數（計數10個隨機選擇的×200視野的EPCs）。

1.4 EPCs黏附能力的檢測 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，將其懸浮于500μL培養液中，計數。每組以相同數目EPCs接種在明膠包被的培養板上，37℃下培養30 min后，計數貼壁細胞。

1.5 EPCs遷移能力的檢測 采用改良的Boyden小室法分析。用0.25%胰蛋白酶消化，搜集貼壁細胞，將其懸浮于500μL培養液中，計數。每組將相同數目的EPCs懸浮于50μL培養液注入上室，下室分別加入DMSO、不同濃度的雷帕霉素和紫杉醇以及25μL培養液，37℃下培養24 h，小心刮去濾膜上層的未移動細胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機選擇3個顯微鏡視野（×200），計數遷移至下層的細胞。

1.6 EPCs增殖能力的檢測 將等量的EPCs接種于明膠包被的96孔培養板上，每孔加入10μL MTT（5 g／L），培養4 h后，去除上清液，再加入DMSO（150μL／孔），用微振蕩器振蕩10 min，用酶標儀于波長490 nm處測OD值。

1.7 統計學處理 采用SPSS16.0軟件包進行分析。數據用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析與兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EPC的鑒定 將大鼠骨髓中分離獲得的細胞培養7 d后，形成了梭形的內皮樣細胞。用DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin對細胞染色后，通過激光共聚焦顯微鏡鑒定，DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs，并在倒置熒光顯微鏡200倍下計數10個隨機選擇的視野中的EPCs。

2.2 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對EPCs數量的影響 雷帕霉素及紫杉醇各組與對照組相比，EPCs數量均較少，差異有統計學意義（P＜0.01）。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的數量逐漸減少（P＜0.05）。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對EPCs的數量的影響無顯著差異（圖1和表1）。

圖1 各組在激光共聚焦顯微鏡下的正在分化的EPCs（×200）

2.3 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對EPCs黏附能力的影響 雷帕霉素和紫杉醇各組與對照組相比，EPCs的黏附能力低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的黏附能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對EPCs黏附能力無顯著影響，見表1。

2.4 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對EPCs遷移能力的影響 雷帕霉素及紫杉醇各組與對照組相比，EPCs遷移能力降低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的遷移能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對EPCs遷移能力無顯著影響，見表1。

2.5 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對EPCs增殖能力的影響 雷帕霉素及紫杉醇各濃度組與對照組相比，EPCs增殖能力降低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的增殖能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對EPCs增殖無顯著影響，見表1。

表1 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對EPCs數量與功能的影響

3 討 論

血管內皮損傷是冠狀動脈斑塊形成中的關鍵起始步驟，因此內皮損傷后的完全修復非常重要。內皮修復可以借助損傷周圍成熟內皮細胞的遷移及增殖完成，但成熟內皮細胞是已分化細胞，其增殖能力有限。EPCs具有分化為成熟內皮細胞的能力，動物實驗及臨床研究表明［1－2］，新生血管中25%的內皮細胞是由EPCs分化而來。EPCs在外傷愈合［3］、心肌梗死后修復［4］及移植血管內皮化［5］等過程中起促進作用。在球囊損傷血管模型中，EPCs能結合到血管損傷部位，促進血管再內皮化［6］。

在心血管病介入治療中，藥物洗脫支架（drug eluting stent，DES）已得到廣泛應用，目前美國食品和藥品監督管理局（FDA）批準的DES為紫杉醇洗脫支架和雷帕霉素洗脫支架。雷帕霉素是一種大環內酯類抗生素，具有抗血管形成、抗腫瘤生長的作用。其與細胞內雷帕霉素連接蛋白結合形成的復合物能抑制調節性激酶－雷帕霉素耙（target of rapamycin，TOR），抑制細胞轉錄過程，從而使細胞分裂受阻于G1期而不能進入S期。在增殖分化的EPCs中也存在調節性激酶TOR，因此雷帕霉素能抑制EPCs的增殖和分化。雷帕霉素可降低體外培養的人外周血來源的EPCs的數量，抑制其增殖、遷移、黏附和血管形成，并抑制內皮一氧化氮合成酶（eNOS）產生［7］。本實驗結果顯示，雷帕霉素可以降低體外培養的大鼠骨髓來源的EPCs的數量，并抑制其增殖、遷移、黏附的能力，且呈濃度依賴性。

紫杉醇是一種抗增殖藥物，它可與微管蛋白結合，穩定微管結構，阻斷細胞有絲分裂，從而抑制細胞的增殖。低劑量的紫杉醇可通過誘導p53／p21腫瘤抑制基因，影響細胞分裂的G0－G1及G1－S期；而高劑量紫杉醇則影響細胞分裂的G2－M期和M－G1期，可能會導致細胞壞死或凋亡。本實驗結果顯示，紫杉醇降低了體外培養的大鼠骨髓來源的EPCs的數量，并且可以抑制其增殖、遷移、黏附的能力，且呈濃度依賴性。

DES的應用顯著降低了支架內再狹窄的發生率，但也導致了血管內皮化延遲以及支架內血栓發生率的增加。雷帕霉素和紫杉醇對EPCs的抑制作用可能是導致內皮化延遲的原因之一，因而用藥物或細胞移植增加EPCs的數量并改善其功能可能會促進DES術后患者內皮的修復，降低支架內血栓發生率。體外實驗［8］顯示，恒磁場可促進EPCs的增殖和遷移，糖原合酶激酶－3β抑制劑加雷帕霉素包被支架可促進EPCs黏附，改善雷帕霉素導致的內皮化延遲。但目前促進內皮修復的辦法尚不能達到理想的遠期效果，需要繼續探討內皮修復的新措施。

［1］ Murohara T，Tepper O，Silver M，et al.Determination of bone marrow－derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor－induced neovascularization［J］.Exp Hematol，2002，30（8）：967－972.

［2］ Suzuki T，Nishida M，Futami S，et al.Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans.A case report of a Tokaimura nuclear accident victim［J］.Cardiovasc Res，2003，58（2）：487－492.

［3］ Gill M，Dias S，Hattori K，et al.Vascular trsuma induces rapid but transient mobilizing of VEGFR2（＋）CD133（＋）endothelial precursor cells［J］.Circ Res，2001，88（2）：167－174.

［4］ Shintani S，Murohara T，Ikeada H，et al.Mobiization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction［J］.Circulation，2001，103（23）：2776－2779.

［5］ Bhattacharya V，McSweeney PA，Shi Q，et al.Enhanced endothelialization and microvessel formation in polyester grafts sedded with CD34（＋）bone marrow cells［J］.Blood，2000，95（2）：581－585.

［6］ Walter DH，Rittig K，Bahlmann FH，et al.Statin therapy accelerates reendothelialization：a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow－derived endothelial progenitor cells［J］.Circulation，2002，105（25）：3017－3024.

［7］ Chen TG，Chen JZ，Wang XX，et al.Effects of rapamycin on number activity and eNOS of endothelial progenitor cells from peripheral blood［J］.Cell Prolif，2006，39（2）：117－125.

［8］ Ma XL，Hibbert B，Dhaliwal B，et al.Delayed re－endothelialization with rapamycin－coated stents is rescued by the addition of a glycogen synthase kinase－3βinhibitor［J］.Cardiovasc Res，2010，86（2）：338－345.