結核分枝桿菌抗體檢測試劑生產質量控制與臨床研究概述

陳保文 都偉欣 楊蕾 王國治

Mtb抗體檢測試劑主要用于檢測人血清或血漿中是否含有Mtb抗體，是結核病的一種臨床輔助診斷方法。目前，我國Mtb抗體檢測試劑的檢測技術多數采用膠體金法和酶聯免疫法，筆者主要針對這兩種檢測技術就Mtb抗體檢測試劑的主要原材料、生產工藝、產品質量控制，以及臨床研究的技術要求進行概述，為Mtb抗體檢測試劑的生產、研制單位及臨床評價單位提供參考。其他檢測技術（如發光免疫法、蛋白芯片法等）的Mtb抗體檢測試劑可加以借鑒。

原材料

一、主要生物原料

主要生物原料包括各種Mtb天然抗原、Mtb重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體等。這類原料主要用于標記膠體金、包被硝酸纖維膜、制備質控線等或用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。

主要生物原料若為企業自己生產，應簡述其制備程序，其中Mtb重組抗原應提供工程菌的構建、工作種子批的制備，生產工藝條件優化參數的建立等各項資料，以確保工藝相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商。如生產工藝或供應商等有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：外觀、純度和相對分子質量（十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳法和高效液相法等）、蛋白質濃度（Lowry法、280nm光吸收法和雙縮脲法等）、效價（一般根據蛋白質濃度通過倍比稀釋法進行）和功能性實驗（至少應有陽性參考品符合率、陰性參考品符合率和最低檢出限），應符合企業生產規定的要求。

二、生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和酪蛋白等。其中牛血清或羊血清的檢定項目至少應包括：外觀、無菌試驗、總蛋白含量和球蛋白含量等，BSA的檢定項目至少應包括：外觀、溶解性、總蛋白含量、總蛋白中的BSA含量、BSA的凈含量等，質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》［1］規定的標準要求。此外，這些生物輔料還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品進行測定，均不能出現非特異性反應。

標記用酶若為辣根過氧化物酶，酶的純度RZ值（德文Reinheit Zahl）應不低于3．0［2］。

三、化學原材料

化學原材料的質量標準參照文獻［1］分析純級別進行檢驗，主要的檢測指標包括：外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。在購入時，生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

四、其他物料

（一）針對酶聯免疫法Mtb抗體檢測試劑

應對酶標板進行外觀、吸附能力和精密性等的檢測。吸附能力和精密性應采用合適的方法進行檢驗，一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算變異系數（coefficient of variation，CV），一般規定CV應 不 高 于10%。

各液體試劑應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如裝量瓶的規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。一般規定裝量應不低于標示量。

（二）針對膠體金法Mtb抗體檢測試劑

硝酸纖維素膜應具有外觀、尺寸、厚度、孔徑大小、毛細遷移速度等要求；玻璃纖維或聚酯纖維膜應具有外觀、厚度、毛細遷移速度、重量等要求；濾紙應具有外觀、厚度、吸水速度、重量、尺寸等要求；塑料墊片應具有厚度、硬度、尺寸、黏性等要求。其偏差范圍應達到企業生產規定的要求。

（三）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》［3］和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》［4］建立相應質量控制。

生產工藝

一、酶聯免疫法Mtb抗體檢測試劑半成品的制備程序

主要包括酶標記抗體的制備（采用常規過碘酸鈉－乙二醇法或其他適宜方法進行酶標記）；包被抗原濃度和酶標記抗體工作濃度的選定（通常采用方陣滴定法）；包被抗原板的制備（采用最佳包被濃度包被微孔板孔，經封閉、干燥和密封等處理后，于2～8℃保存）；陰性陽性對照（若選用人或動物的血清或血漿，一般經60℃、1h進行處理后，除菌過濾，于2～8℃保存）、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等各種工作液的配制。特別應注意的是，若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

應對包被抗原板按半成品質量控制的標準進行抽樣檢定，并應符合相應項的規定要求。各種工作液應有明確的配方及嚴格的配制程序，其質量控制主要包括酶結合物的功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定；檢測過程中加入樣本后的反應時間、加入酶結合物后的反應時間，以及加入顯色液后的顯色時間應進行優化，并制定合理的限定指標。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

二、膠體金法Mtb抗體檢測試劑半成品的制備程序

主要包括膠體金及膠體金標志物的制備（采用枸櫞酸三鈉還原法或其他方法制備膠體金和膠體金標志物）；膠體金標志物、包被抗原或抗體工作濃度的選定（通常采用方陣滴定法）；膠體金標志物的包被；在硝酸纖維素膜上制備檢測線和質控線；貼膜、切割及組裝；陰性、陽性對照（若選用人或動物的血清或血漿，一般經60℃、1h進行處理后，除菌過濾，于2～8℃保存）及樣品稀釋液、洗滌液、封閉液等各種工作液的配制。特別應注意的是，若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

應對膠體金及膠體金標志物進行外觀、pH值、膠體金顆粒大小、粒徑的均一性，以及最大吸收波長等的檢測；檢測線和質控線應具有間隔距離要求；切割的膜條應有寬度要求。

三、成品的分批、分裝和包裝

按照文獻［2］中“生物制品分批規程”“生物制品分裝和凍干規程”及“生物制品包裝規程”進行分批、分裝與凍干和包裝。

質量控制

一、半成品質量控制

以國家參考品或企業參考品進行半成品質量控制。檢定項目至少應包括陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、精密性（或重復性）和最低檢出限。

（一）陰性參考品

至少采用5份來自非結核病志愿者（包括健康人和至少1份非結核病的其他肺部疾病患者）的血清或血漿。規定：檢測結果應全部呈陰性或允許1份呈假陽性。

（二）陽性參考品

至少采用5份來自結核病患者的血清或血漿，應選擇抗體效價分別呈強陽性、中陽性、弱陽性和臨界的樣本。規定：檢測結果應全部呈陽性或允許1份呈假陰性。

（三）精密性（或重復性）參考品

至少采用1份來自結核病患者的血清或血漿，盡可能選擇抗體效價呈弱陽性的樣本。對于酶聯免疫檢測試劑，規定CV（%）應不高于15%（n＝10）；對于膠體金檢測試劑，規定檢測結果應全部呈陽性，且顯色一致（n≥5）。

（四）最低檢出限參考品

采用1份來自結核病患者的血清或血漿，盡可能選擇檢測結果呈強陽性的樣本，然后用適宜的稀釋液進行倍比系列稀釋，至少含3個稀釋度。規定：某一稀釋度的樣品應呈陽性，某一稀釋度的樣品可陰可陽，某一稀釋度的樣品應呈陰性。

二、成品質量控制

每一批酶聯免疫檢測試劑報批批量至少為10 000人份，每一批膠體金檢測試劑報批批量至少為3000人份。一般使用國家參考品或經國家參考品標化的企業參考品進行檢驗。若使用企業參考品進行質量控制，應提供企業參考品制備和標化的技術資料，其中制備部分應提供各份樣品來源的詳細材料，陽性樣品應有涂片和培養的檢測結果，應提供分裝規格和分裝數量的數據；標化部分應提供候選樣品的效價測定方法和測定結果等。

成品質量控制技術指標的要求應包括以下幾點：

（一）物理檢查

1．酶聯檢測試劑：應對試劑盒外觀、試劑盒中各液體組分（如陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物液、終止液等）及酶標板外觀等進行檢查，應符合相應的質量標準。

2．膠體金檢測試劑：應對試劑盒外觀、檢測板、試劑盒中各液體組分（如陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、封閉液等）、液體移行速度及膜條寬度等進行檢查，應符合相應的質量標準。

（二）功能性檢測

1．陰性參考品：采用10～20份來自非結核病志愿者（包括健康人和至少1份非結核病的其他肺部疾病患者）的血清或血漿。規定：檢測結果應全部呈陰性或允許1份呈假陽性。

2．陽性參考品：采用10～20份來自結核病患者的血清或血漿，應選擇抗體效價分別呈強陽性、中陽性、弱陽性和臨界的樣本，還需考慮選擇來自菌陰和菌陽、不同病程、肺內和肺外結核等患者的樣本。規定：檢測結果應全部呈陽性或允許1份呈假陰性。

3．精密性（或重復性）參考品：至少采用1份來自結核病患者的血清或血漿，盡可能選擇抗體效價呈弱陽性的樣本。對于酶聯免疫檢測試劑，規定CV（%）應不高于15%（n＝10）；對于膠體金檢測試劑，規定檢測結果應全部呈陽性，且顯色一致（n≥5）。

4．最低檢出限參考品：采用1份來自結核病患者的血清或血漿，盡可能選擇檢測結果呈強陽性的樣本，然后用適宜的稀釋液進行倍比系列稀釋，至少含3個稀釋度。規定：某一稀釋度的樣品應呈陽性，某一稀釋度的樣品可陰可陽，某一稀釋度的樣品應呈陰性。

（三）穩定性試驗

可以用熱穩定性試驗來替代，溫度一般選 （37±1）℃，放置時間可根據試劑盒的有效期而定，一般有效期6個月的產品37℃加熱至少3d。有效期更長的產品應根據企業加速試驗研究結果視情況而定。

臨床研究

一、基本原則

（一）基本要求

Mtb抗體檢測試劑一般采用血清、血漿、腦脊液、胸腔、腹腔積液等為研究樣本，需征求受試者的同意，并簽署知情同意書。

（二）臨床研究單位及人員的要求

應為從事人類健康或疾病預防、診斷、治療以及流行病學調查等活動的法人單位，而且進行研究的產品應該在其所從事的專業范圍以內。必須具有相應專業的技術人員以及與研究試劑相適應的儀器設備。臨床研究一般應在至少2家以上（含2家）省級醫療衛生單位完成。注冊申請人應根據產品特點及其臨床使用目的，綜合不同地區人種、流行病學背景、病原微生物的特性等因素選擇研究單位。在臨床研究全過程中，注冊申請人應考慮吸收流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等方面專業人員（或知識），以保證研究方法科學、合理［5］。

二、臨床研究設計原則

（一）結核病診斷標準

依據 WS288－2008《肺結核診斷標準》［6］進行肺結核的診斷及鑒別。

（二）研究對象的選擇

研究對象包括2組：（1）隨機選用就診懷疑結核病的患者，按文獻［6］進行診斷；（2）正常人群。臨床評價結束后，將（1）中入組人員分為以下兩類人群進行數據處理：①結核病患者，包括菌陰和菌陽、不同病程、肺外結核等患者；② 非結核病患者，包括易與結核病相混淆的患者（如肺癌、細菌性肺炎、肺真菌病等）以及其他患者（如哮喘、氣管炎等）。最終數據統計分析時，將 ②和（2）中人群合并作為非結核病的對照組，而①則作為結核病患者組。

（三）樣本量

依據《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》［7］第十二條規定，Mtb抗體檢測試劑屬第三類產品。《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》［5］中規定一般情況下第三類產品的臨床研究的總樣本數至少為1000例，在符合指導原則有關最低樣本量要求的前提下，還應符合統計學要求。

（四）對比試劑

應選擇已批準上市且臨床普遍認為質量較好的產品，同時應充分了解所選擇產品的技術信息，包括方法學，臨床使用目的和范圍，主要性能指標、標準品或校準品的溯源情況、推薦的參考值（參考范圍）等，以便對試驗結果能夠進行科學的分析。

（五）實驗方法

1．痰涂片：參照文獻［6］和［8］，以臨床研究單位常規的痰涂片方法進行操作。

2．痰培養：參照文獻［6］和［8］，將收集的痰標本采用臨床研究單位常用的痰標本“前處理”方法進行液化，然后接種改良羅氏培養基或者也可聯合采用快速培養法。

3．抗體檢測：嚴格按Mtb抗體檢測試劑中所附的說明書進行操作。

4．臨床診斷：依據文獻［6］進行確診。

（六）實驗結果確認

1．實驗結果分類：具體見表1。

2．實驗結果判定：（1）A類：細菌學及抗體檢查均為陽性，臨床確診為結核病，抗體檢測結果判定為真陽性。（2）B類：細菌學檢查為陽性，抗體檢查為陰性，臨床確診為結核病，抗體檢測結果判定為假陰性。（3）C類：細菌學檢查為陰性，抗體檢查為陽性，臨床確診為結核病，抗體檢測結果判定為真陽性。（4）D類：細菌學檢查為陰性，抗體檢查為陰性，臨床確診為結核病，抗體檢測結果判定為假陰性。（5）E類：細菌學檢查為陰性，抗體檢查為陽性，臨床確診為非結核病，抗體檢測結果判定為假陽性。（6）F類：細菌學檢查為陰性，抗體檢查為陰性，臨床確診為非結核病，抗體檢測結果判定為真陰性。

表1 實驗結果分類

3．特異度和靈敏度的計算：被考核的 Mtb抗體檢測試劑的特異度（%）為F／（E＋F），靈敏度（%）為（A＋C）／（A＋B＋C＋D）。

三、關于臨床研究報告的撰寫

臨床研究報告的格式及內容應包括以下內容。

（一）首篇

首篇是每份臨床研究報告的第一部分，所有單個的臨床研究報告均應包含該部分內容。主要有封面標題、目錄、研究摘要、試驗主要研究人員的姓名、單位和在研究中的職責及其簡歷（列于附件中）、縮略語等。

（二）正文內容和報告格式

1．基本內容：應包括引言、研究目的、試驗管理、試驗設計、臨床研究結果及分析、討論和結論等。其中試驗設計中應包括：樣本量及樣本量確定的依據；樣本選擇依據、入選標準、排除標準和剔除標準；樣本采集、保存、運輸方法等；金標準或對比試驗產品的確立；臨床研究用所有產品的名稱、規格、來源、批號、有效期及保存條件，對比試驗產品的注冊情況；質量控制方法；臨床研究數據的統計分析方法；研究過程中方案的修改。

2．有關臨床研究中特別情況的說明。

3．附件：應包括臨床研究中所采用的所有診斷試劑產品的使用說明書、臨床研究中的所有試驗數據，以及主要參考文獻等。

討 論

WHO于2011年7月20日公布的一項政策建議中指出，使用目前市面上商業性血液（血清學）檢測手段診斷活動性結核病，常常導致誤診和不當治療，進而損害公眾健康。WHO敦促各國采用其推薦的準確的微生物或分子檢測方法，禁止使用不準確的和未經批準的血液檢測方法［9］。

針對WHO提出的這項建議，國家食品藥品監督管理局于2012年4月16日發布了進一步加強結核病血液檢測試劑有關事宜通知：（1）結核病血液檢測試劑僅用于結核病臨床輔助診斷。（2）按照《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械［2007］229號）的規定，與Mtb檢測相關的試劑屬于第三類體外診斷試劑。參見文獻［10］。

我國是結核病發病大國，位居世界第二。Mtb抗體檢測試劑盡管特異度和靈敏度均存在一定局限，但因其具有簡便、快速的特點而倍受青睞，尤其適用于我國條件較差的基層醫療機構。鑒于WHO提出的這項建議，已批準的和正在進行注冊或研制結核病血液（血清學）檢測試劑的單位均應嚴格把好質量關，臨床研究單位應嚴謹、規范和科學地制定臨床考核方案，以確保我國的結核病血液學檢測試劑在結核病診斷上起到輔助診斷的良好作用。

［1］中國生物制品標準化委員會．中國生物制品主要原輔材料質控標準．北京：化學工業出版社，2000．

［2］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（三部）．北京：中國醫藥科技出版社，2010：6－8，333．

［3］國家食品藥品監督管理局．體外診斷試劑說明書編寫指導原則．北京：國家食品藥品監督管理局，2007．

［4］國家食品藥品監督管理局．醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定．2004－07－08．

［5］國家食品藥品監督管理局．體外診斷試劑臨床研究技術指導原則．北京：國家食品藥品監督管理局，2007．

［6］中華人民共和國衛生部．WS288－2008肺結核診斷標準．北京：人民衛生出版社，2008．

［7］國家食品藥品監督管理局．體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）．2007－04－19．

［8］中國防癆協會基礎專業委員會．結核病診斷實驗室檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006：13－45．

［9］World Health Organization．WHO warns against the use of inaccurate blood tests for active tuberculosis［EB／OL］．WHO，Geneva，2011［2011－07－20］．http：／／www．who．int／mediacentre／news／releases／2011／tb＿20110720／en／．

［10］國家食品藥品監督管理局辦公室．關于進一步加強結核病血液檢測試劑監管有關事宜的通知．北京：國家食品藥品監督管理局，2012．