雙波長分光光度法測定飼料中鐵含量

淮海工學院化學工程學院 李詠梅 施鵬飛

連云港師范高等專科學校 李人宇＊

鐵是動物的必需微量元素之一。日糧中鐵含量不足會引起動物生長受阻，血紅蛋白合成不良，從而出現貧血癥（張元躍，2002），而動物攝入過量鐵則會發生鐵中毒（楊順江，1989）。因此，準確測定飼料中鐵含量具有重要意義。二元絡合物體系鄰菲啰啉光度法是測定鐵的傳統方法，此法靈敏度較低，反應2 h后才能穩定可測，且選擇性較差（王書華和董士元，1997）。近年來，三元絡合物體系光度法因具有靈敏度高、穩定性好、選擇性好等優點應用日益增多（王愛榮等，2005）。此外，雙波長分光光度法因能提高準確度、靈敏度和選擇性等分析性能而備受關注（陳孝進等，2012；畢韶丹等，2008）。本實驗利用鐵（Ⅱ）-鄰菲啰啉-燦爛黃三元絡合物體系，建立雙波長分光光度法測定飼料中鐵含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 756CRT型紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），HH-2數顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司），pHS-3C型酸度計（上海精密科學儀器有限公司），XS2馬弗爐（宜興市前錦爐業設備有限公司）。

鐵（Ⅱ）標準儲備溶液（100 μg/mL）：準確稱取0.7020 g 硫酸亞鐵銨，溶于硫酸 （V∶V=1∶1）50 mL中，定容于1 L容量瓶，貯存于聚乙烯瓶中，4℃保存。鐵（Ⅱ）標準工作溶液（10 μg/mL）：精密吸取10.0 mL鐵（Ⅱ）標準貯備溶液，用水稀釋定容至100 mL；乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：pH 5.7；鄰菲啰啉溶液：1.0 ×10-3mol/L；燦爛黃溶液：1.0 ×10-4mol/L。實驗所用硫酸、鹽酸、鹽酸羥胺均為優級純，其他試劑為分析純，水為雙蒸水。

1.2 實驗方法 在10mL比色管中依次加入1.0 mL pH 5.7乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，一定量鐵（Ⅱ）標準工作溶液或樣品溶液，1.5 mL 1.0×10-3mol/L鄰菲啰啉溶液和3.0 mL 1.0×10-4mol/L燦爛黃溶液，用水定容并搖勻，室溫下靜置15 min。同時配制空白試劑。用1 cm比色皿，以空白試劑為參比，分別于波長493 nm和379 nm處，測量絡合物體系的吸光度A493和A379，按公式△A=A493–A379，計算吸光度差值△A。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜 以水為參比，分別掃描空白試劑、絡合物溶液，吸收光譜，結果見圖1。由圖1可見，在pH 5.7乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，空白試劑的最大吸收波長位于387 nm。當鐵（Ⅱ）加入其中后，使燦爛黃褪色，379 nm處的吸光度隨著鐵（Ⅱ）濃度增大而減小；生成絡合物的最大吸收峰位于493 nm，493 nm處的吸光度隨著鐵 （Ⅱ）濃度增大而增大。由于△A值與鐵（Ⅱ）濃度存在很好的線性關系，故選取λ1=493 nm作測量波長，λ2=379 nm作參比波長，采用雙波長光度法測定。

2.2 測定條件的優化

2.2.1 酸度的影響 不同酸度的介質對絡合反應的發生與進程有很大影響，分別以乙酸-乙酸鈉（pH3.6～ 5.7），乙酸銨 （pH7.0）和氨-氯化銨（pH7.5～11.0）緩沖溶液作為反應介質進行試驗，結果表明，選擇pH 5.7乙酸-乙酸鈉緩沖溶液控制體系酸度，且用量為1.0 mL時，△A值最大（圖2、圖3）。而當pH＜4.0時，試劑空白褪色太快無法準確測定吸光度；當pH＞8.0時，△A值接近零，說明反應基本不發生。因此，本實驗選擇加入pH 5.7乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用量為1.0 mL。

2.2.2 鄰菲啰啉用量的影響 鄰菲啰啉用量對絡合物的生成有較大影響。當1.0×10-3mol/L的鄰菲啰啉溶液用量為1.5～3.0 mL時，ΔA值最大 （圖4）。而當鄰菲啰啉用量小于1.5 mL時，鄰菲啰啉與鐵（Ⅱ）絡合形成 Fe（phen）32+的能力減弱，反應速度變慢，反應不完全且難以穩定，ΔA值較小，測定的準確性和靈敏度均降低。本實驗確定鄰菲啰啉溶液加入量為1.5 mL。

圖1 吸收光譜

2.2.3 燦爛黃用量的影響 燦爛黃用量對絡合物的生成有較大影響。當1.0×10-4mol/L燦爛黃溶液用量為2.8～4.0 mL時，△A值最大（圖5）。而當燦爛黃用量小于 2.8 mL 時，Fe（phen）32+與燦爛黃陰離子之間的靜電引力和疏水作用力減弱，反應速度變慢，不利于絡合反應的完成，△A值較小，測定的準確性和靈敏度均降低。本實驗確定燦爛黃溶液的加入量為3.0 mL。

2.2.4 反應溫度的影響 由圖6可見，當溫度為10～40℃時，△A值基本不變；當溫度為50～100℃時，△A值升高但很不穩定。這是由于高溫條件會使絡合體系產生渾濁，使△A值增大且不穩定。為了保證測定的準確度，并便于操作，本實驗選擇室溫下反應。

2.2.5 反應時間與穩定性 由圖7可見，反應開始后，△A值迅速增大，反應15 min時，△A值達到最大，并保持6 h基本不變。本實驗選擇反應時間為15 min。本方法生成的三元絡合物與王書華和董士元（1997）報道的二元絡合物相比，穩定性明顯提高，反應時間由2 h縮短為 15 min，大大提高了分析效率。

2.3 工作曲線與檢出限 在一組10 mL比色管中，分別準確加入10 μg/mL鐵（Ⅱ）標準工作溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL， 按實驗方法測量體系吸光度，繪制工作曲線（圖8）。由8可見，線性范圍為0～1.2 μg/mL，線性回歸方程為 ΔA=0.5858 Ρ （μg/mL）+0.0075， 相關系數r=0.9999。 表觀摩爾吸光系數 ε=3.3×104L/mol·cm，較何建英等（2003）二元絡合物體系鄰菲啰啉光度法靈敏度提高2倍。對空白試劑進行11次測定，求得標準偏差s=2.7×10-3，方法檢出限為DL=3s/k=13.8 μg/L。

2.4 共存離子的影響 在上述實驗條件下，對10mL溶液中10 μg鐵 （Ⅱ）進行測定，相對誤差≤ ±5%范圍內，常見離子的允許量（以μg計，未做上限）分別為：Na+、NH4+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、I-、NO3-、SeO32-（1000），K+、Cr3+、OH-、HCO3-、CO32-、Br-（500），Zn2+（100），Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+（10）。結果表明，該方法具有良好的選擇性。加入0.5 mL 0.5%檸檬酸可掩蔽1 mg Ni2+，加入0.4 mL 5%硫脲溶液可掩蔽1 mg Cu2+，加入1.2 mL 0.5%氟化鈉可掩蔽1 mg Fe3+（用于價態分析）。對于常見飼料無需掩蔽可直接測定。

3 樣品分析

準確稱取適量飼料樣品（豆粕2.0 g，玉米5.0 g）于瓷坩堝中，放在電熱板上低溫炭化至無煙，再放入馬弗爐于500℃下灰化4～5 h，直至試樣灰化完全后取出。 稍冷加入 5 mL（V∶V=1∶1）鹽酸，加入1 mL 10%鹽酸羥胺溶液，放在電熱板上加熱微沸數分鐘，以保證全部鐵的溶解和還原，冷卻后移入50 mL容量瓶中，用水定容、過濾。精密吸取1.0 mL按實驗方法測定鐵含量，測定結果與國標法一致（表 1）（GB/T 13885-2003，2003）。 同時進行加標回收實驗，結果見表2。

表1 回收率實驗結果

表2 飼料樣品中鐵含量的測定結果（n=5）

4 結論

本實驗建立了鐵 （Ⅱ）-鄰菲啰啉-燦爛黃三元絡合物體系雙波長分光光度法測定飼料中的鐵含量，方法靈敏度和穩定性明顯優于傳統的鄰菲啰啉光度法，測定快速準確，精密度高，選擇性好，完全滿足飼料中鐵含量的檢測要求。

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[6]楊順江.動物微量元素營養學[M].湖北：湖北科學技術出版社，1989.125～138.

[7]張元躍.動物的鐵需要量與補鐵[J].中國飼料，2002，7：22 ～ 23.

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