生長譜法測定微生物碳源譜的實驗探索*

杜東霞

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東 菏澤 274015)

微生物的生長繁殖，需要不斷地從外界汲取必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)能夠為微生物提供能量、結(jié)構(gòu)物質(zhì)、代謝調(diào)節(jié)因子等，如果缺少其中的一種或幾種，就會產(chǎn)生短板效應(yīng)，微生物就不會生長.碳源在微生物體內(nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學(xué)變化能夠為有機(jī)體的各種生理活動提供所需的能量，微生物能夠利用的碳源有糖類、醇類、醛類、有機(jī)酸類和脂類等，其中糖類是應(yīng)用最廣泛的碳源.為了確定不同微生物對不同碳源的利用程度，可以將每種微生物和缺少碳源的合成培養(yǎng)基制作混菌平板，然后將各種碳源利用打孔法、糖浸片法和糖粒法點植于混菌平板上，隨著該營養(yǎng)物在植點周圍擴(kuò)散，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，在營養(yǎng)物的擴(kuò)散處微生物開始生長繁殖，并使指示劑變?yōu)辄S色，可以根據(jù)變黃范圍的大小初步判斷該微生物對不同碳源的利用程度.由于該方法能夠使微生物生長之處出現(xiàn)生長圖形，因而稱之為生長譜法.該方法在生物教學(xué)中廣泛用于各種微生物對不同營養(yǎng)需求的定性和定量的研究［1～5］.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌(Escherichia coli);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);普通變形桿菌(Proteus vulgaris);金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).

1.1.2 合成培養(yǎng)基

先將100 g黃豆芽在1 L蒸餾水中煮沸約30 min，用4層紗布過濾，然后取其汁液10 mL，20 g瓊 脂，1 g(NH4)3PO4，0.2 gKCl，0.2 g MgSO4·7H2O，放入燒杯中，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié) pH值至7.0.最后加入約24 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的溴甲酚紫作指示劑(pH 5.2 ～ pH 6.8，顏色由黃色變?yōu)樽仙?，在121℃下滅菌20 min.

1.1.3 糖類

葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖及其圓形濾紙?zhí)墙?6種糖分別編號為 A，B，C，D，E，F(xiàn)).

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng).

1.2.2 制備菌懸液

在無菌條件下，用接種環(huán)分別刮取四種斜面菌落于無菌水中制備菌懸液.

1.2.3 制備混菌平板

將固體合成培養(yǎng)基斜面加熱融化后，冷卻至50℃ 左右，每支加入1 mL菌懸液，充分混勻后分別制備大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌混菌平板.

1.2.4 制作糖浸片

用圓形打孔器制備直徑約為0.4 cm的圓形濾紙片，在不同糖的飽和溶液中浸泡10 min，在紫外燈下照射20～30 min至完全干燥.

1.2.5 混菌平板分區(qū)植糖

分別在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌的混菌平板(每種平板3個，分別編號為甲、乙和丙)背面劃分6個均勻的植糖區(qū)域，如圖1所示.現(xiàn)以大腸桿菌為例，先用接種環(huán)分別挑取6種糖粒(小米粒大小)點植于大腸桿菌甲混菌平板的相應(yīng)區(qū)域;接著用無菌鑷子夾取6種不同的糖浸片，點植于大腸桿菌乙混菌平板的相應(yīng)區(qū)域;大腸桿菌丙混菌平板的相應(yīng)區(qū)域用打孔器打孔，每孔注入30 μL相應(yīng)的飽和糖溶液.

圖1 混菌平板背面均勻分布的6個植糖區(qū)域

1.2.6 培養(yǎng)及觀察

置糖混菌平板37℃先正面培養(yǎng)2 h，再倒置培養(yǎng)過夜，觀察不同方法的實驗效果.

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌碳源譜結(jié)果比較

大腸桿菌碳源譜實驗結(jié)果，如圖2所示.

圖2 三種方法大腸桿菌碳源譜結(jié)果比較

指示劑溴甲酚紫會使生長區(qū)域變?yōu)辄S色，圖2a采用糖粒法，變黃現(xiàn)象不明顯，而且變色圈很容易相互交叉重疊;圖2b采用糖浸片法，該方法一定程度上要優(yōu)于糖粒法，但是效果還不夠明顯;圖2c采用打孔法，效果很明顯，該方法優(yōu)于糖粒法和糖浸片法.

2.2 四種微生物碳源譜的結(jié)果比較

利用打孔法鑒定的四種微生物對不同糖類的利用程度，見表1.

表1 四種微生物對不同糖類的利用

3 討論

和傳統(tǒng)的糖粒法和糖浸片法相比較，改進(jìn)的打孔法為不同微生物各種營養(yǎng)物質(zhì)利用程度的測定提供了一種新方法，該方法具有如下優(yōu)點.

首先，該方法簡單易行，雖然糖粒法操作也簡易，但糖粒的點植比較困難，難免在點植的周圍散落糖粉，再者糖粒的大小也不好控制，很難達(dá)到大小一致，這就造成點植糖量的不均一;糖浸片法操作較繁雜，不好定量，而且不易于糖份在平板上的擴(kuò)散，倒置培養(yǎng)容易從平板上脫落.而打孔法不但操作簡易，而且容易定量，效果顯著.

其次，實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，相對于糖粒法和糖浸片法，打孔法定量植入，而且擴(kuò)散快，反應(yīng)迅速，效果明顯，避免了傳統(tǒng)方法定量和擴(kuò)散上的困難.

最后，易于嚴(yán)格的無菌操作，可以大大降低雜菌的污染.對比實驗表明，糖粒法污染較為嚴(yán)重，糖浸片法次之，而打孔法將污染降到了最低，而且效果顯著，能夠在實驗教學(xué)中大幅度提高生長譜測定的成功率.

［1］辜建平，張慶，劉邦芳，等.微生物生長譜法實驗技術(shù)的改進(jìn)與探析［J］.微生物學(xué)通報，2005，32(1):90－93.

［2］康振，耿艷平，張園園，等.好氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸工程菌株的構(gòu)建［J］.生物工程學(xué)報，2008，24(12):2081－2085.

［3］沈萍.微生物學(xué)實驗［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］周德慶.微生物學(xué)實驗教程［M］.北京:高等教育出版社，2006.

［5］方德華，魏新元，申鴻.微生物實驗技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.