熒光定量RT-PCR檢測宮頸癌患者外周血MMP-9 mRNA表達的臨床意義

董小躍，張盛燕

（瑞安市婦幼保健院婦產科，浙江 瑞安 325200）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。雖宮頸癌的診斷及治療方面取得一定的進展，但仍有20%～34%的早期宮頸癌患者最終死于腫瘤的復發和轉移。血循環中微轉移的存在，提示腫瘤已不再局限于原發灶，有發展為遠處轉移的可能。早期診斷外周血中的微轉移，有助于我們更有針對性地進行個體化的術后輔助治療，減少復發和轉移，提高患者的生存率和生活質量。本研究利用RT-PCR技術檢測早期宮頸癌外周血中上皮源性特異性標志基因MMP-9 mRNA的表達，探討它們在宮頸癌外周血中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2005年1月至2010年6月間我院首診的98例宮頸癌患者為研究對象。年齡22～78歲，平均48歲。臨床分期[按照2000年國際婦產科聯盟(FIGO)的標準]：ⅠA期8例，ⅠB期48例，ⅡA期7例，ⅡB 22例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。按病理類型：鱗癌85例，非鱗癌13例；所有早期宮頸癌患者均予子宮次廣切或子宮廣切及盆清術，術后標本均行病理檢查。對照組為同期手術的婦科良性腫瘤25例，其中子宮肌瘤18例，卵巢囊腫3例，子宮肌腺癥1例，子宮內膜異位癥3例。

1.2 主要試劑和儀器 Trial試劑(GIBLO公司)；逆轉錄酶M2MLV(Promega公司)；Taq酶(Sangon公司)；Light Cycler熒光PCR儀(德國Roche公司)。

1.3 方法 患者初診治療前抽取靜脈血5 ml(棄去開始的1 ml，以防上皮細胞污染)，于20 min內用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。用Trizol試劑(上海復星公司)進行總RNA的提取。測A260～280處的吸光值，并計算RNA含量。然而進行逆轉錄反應合成cDNA后再行PCR擴增。PCR反應條件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，共做40個循環。結果分析參考試劑盒。

2 結果

2.1 宮頸癌及婦科良性腫瘤的MMP-9 mRNA轉錄 宮頸癌組外周血MMP-9 mRNA有75例陽性，表達率為76.5%(75/98)，而對照組有12例陽性，表達率為48.0%(12/25)，兩組比較差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)。在宮頸癌組內，早期（ⅠA+ⅠB+ⅡA）宮頸癌外周血MMP-9 mRNA有40例陽性，表達率為63.5%(40/63)，而中晚期（ⅡB+Ⅲ+Ⅳ）宮頸癌有31例陽性，表達率為88.6%(31/35)，兩組比較差異存在統計學意義(P＜0.05)。

2.2 MMP-9 mRNA的表達與早期宮頸癌的單因素分析 ①年齡：年齡＜40歲的早期宮頸癌MMP-9 mRNA表達陽性與陰性比例分別為16例(40.0%)vs 4例(17.4%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。②腫瘤分期：早期宮頸癌ⅠA、ⅠB、ⅡA MMP-9 mRNA表達陽性與陰性比例分別為6例(15.0%)vs2例(8.7%)，30例(75%)vs 18例(78.3%)，4例(10.0%)vs 3例(13.0%)，差異無統計學意義(P＞0.05)。③病理類型：早期宮頸癌病理類型中非鱗癌MMP-9 mRNA表達陽性與陰性比例分別為10例(25%)vs 2例(8.7%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。④病理分化：表達MMP-9 mRNA的早期宮頸癌與未表達MMP-9 mRNA的早期宮頸癌低分化分別有14例(35%)和4 例(17.4%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。⑤淋巴結轉移：早期宮頸癌淋巴結轉移者MMP-9 mRNA表達陽性與陰性比例分別為6例(15%)vs 2例(8.7%)，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 MMP-9 mRNA的表達與早期宮頸癌臨床病理因素分析

3 討 論

宮頸癌的復發轉移是導致治療失敗及造成患者死亡的主要原因[1]，因此，如何更早發現亞臨床期病變、評估治療效果、監控復發是當前需要解決的關鍵問題。而腫瘤的微轉移[2]是腫瘤復發轉移的基礎和前提.因此早期診斷腫瘤的微轉移對指導個體化治療和判斷預后具有重要臨床價值。RT-PCR技術的靈敏性較高，可檢出1×107個正常細胞中的1個腫瘤細胞，使外周血微轉移檢測成為可能。實時熒光定量聚合酶鏈式擴增反應（PCR）作為一項新技術，可檢測出106～108個單個核細胞中的一個腫瘤細胞，其巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，借助熒光信號檢測PCR產物。與普通PCR或巢式PCR相比，實時熒光定量PCR具有更可靠的靈敏度和特異性，其自動化的檢測能最大限度減少污染，顯著減少假陽性的發生率[3]。

基質金屬蛋白酶是一個大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。基質金屬蛋白酶（MMPs）幾乎能降解細胞外基質（ECM）中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，從而在腫瘤浸潤轉移中的作用日益受到重視，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶。MMP-9是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的一員，為Ⅳ型膠原酶，可有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原及明膠，它的異常表達與人類許多惡性腫瘤的轉移密切相關。在腫瘤組織中發現細胞角蛋白的存在，則意味著微轉移的發生[4]。

本研究采用RT-PCR技術檢測宮頸癌外周血中MMP-9 mRNA的轉錄。結果發現，MMP-9 mRNA在宮頸癌和對照組中的陽性率分別為76.5%和48.0%，兩者差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。在宮頸癌中，中晚期宮頸癌外周血MMP-9 mRNA陽性率明顯高于早期宮頸癌(88.6%vs 63.5%)，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。以上資料表明在宮頸癌外周血中存在表達MMP-9 mRNA的腫瘤細胞；同時MMP-9 mRNA的轉錄均顯示了很高的特異性，通過RT-PCR技術檢測宮頸癌外周血中腫瘤細胞具有較好的敏感性和特異性。

目前，盡管早期宮頸癌的5年生存率達85%～90%，但臨床醫師發現一部分無高危因素的，術后很快發生盆腔復發和轉移的患者，預后較差。有關預后因素的探討被引為宮頸癌臨床處理依據或參考的有：腫瘤體積大小、宮頸間質浸潤深度、宮頸癌生長形態及癌細胞類型、淋巴血管受侵、淋巴結轉移、腫瘤組織非鱗癌成分；以及手術標本切緣與年齡、貧血[5]。文獻報道，MMP-9 mRNA的轉錄與胃腸道、肺、乳腺等惡性腫瘤的預后因素如分期、浸潤深度、淋巴結轉移有關[6]。在本研究中，表達MMP-9 mRNA的早期宮頸癌與未表達MMP-9 mRNA的早期宮頸癌相比，年輕、低分化及鱗癌更多見，差異有統計學意義。上述資料提示微轉移可能與上述因素有關，而其作用機制有待進一步探索和證實。對于MMP-9 mRNA患者給予加強預后監測或預防性治療，可減少遠處轉移，改善預后，提高生存率。

[1]牟 玲,呂鳳林,汪 云,等.HPV18 E2基因在宮頸癌及癌前病變組織中的表達及其臨床意義[J].重慶醫學,2008,37(20):2321-2324.

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