乙酰肝素酶在子癇前期孕婦胎盤中的表達研究

周露 崔敏 于達

大連婦產醫院，遼寧大連 116000

妊娠期高血壓疾病子癇前期是影響孕產婦及圍生兒發病率及死亡率的嚴重產科并發癥，其病因及發病機制較為復雜，目前，關于其病因學方面的研究有多種理論，如內皮細胞損傷、功能障礙、結構損傷、滋養細胞過度凋亡、免疫炎癥反應等。近年來經過專家學者的研究發現，子癇前期重度孕婦血液中的肝素水平下降為正常孕婦的50%[1]，血液呈高凝狀態，臨床采用肝素抗凝治療取得了較明顯的效果。1999年，以色列科學家Vlodavsky I等[2]從胎盤中成功克隆純化出一種名為乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）的物質，之后，對其研究深入開展。那么Hpa與孕婦肝素水平下降[1]及血管內皮損傷又有怎樣的關系呢？本實驗就是圍繞這個問題而開展的。

Hpa是目前發現的能夠降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖 （heparan sulfate proteogly can，HSPGs）和側鏈肝素（heparan sulfate，HS）及其衍生物的酶[3]，它廣泛存在于胎盤滋養細胞、血小板、巨噬細胞、活化的T、B淋巴細胞和癌細胞等多種細胞中，通過水解其底物來參與一系列的生理和病理過程，如胚胎發育、形態發生、血管形成及組織修復、炎癥、自身免疫、腫瘤生長和轉移等。產科領域，在胚泡植入、胎盤形成、分娩發動及產科并發癥中均有較為重要的作用。Hpa在胎盤中的定位怎樣？它在正常孕婦、子癇前期輕度及子癇前期重度孕婦胎盤中的蛋白含量是否有顯著性差異？能否反映病情輕重？本實驗用Western-blot來明確Hpa在子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦胎盤中的定位情況及其蛋白表達水平與病情輕重的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

取遼寧大連婦產醫院2010年10月～2011年10月住院患者胎盤組織43例，分為3組，其中，正常對照組13例，子癇前期輕度15例，子癇前期重度15例。3組在年齡、孕周、孕產次、體重、身高等方面差異無統計學意義（P＞0.05）。無妊娠期糖尿病、感染性疾病、肝、腎病和原發性高血壓等疾病，且未用過與此實驗相關的藥物治療。子癇前期患者的診斷標準以第七版《婦產科學》為依據。所取組織為臍帶根部胎盤全層1 cm3。受試者資料詳見表1。

表1 孕婦一般情況及胎兒情況

1.2 一般組織學處理

用于Western blot分析的新鮮組織，于術中切除后，立即于-80℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與方法

Western-blot肝素酶一抗，堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG二抗和NBT/BCIP染色試劑盒購自武漢博士得生物有限公司。取新鮮胎盤組織全層1 cm3，加入裂解緩沖液，剪碎，勻漿，低溫超速離心（4℃，13 000 r/min，30 min），提取上清液為細胞總蛋白，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉印，5%正常小牛血清封閉，一抗（1∶500）4℃下孵育，過夜；與二抗室溫下孵育1 h，NBT/BCIP顯色30 min，水洗干燥，避光保存，測定灰度值比較結果。

1.4 統計學方法

應用SPSS 12.0軟件進行統計學處理；乙酰肝素酶蛋白相對含量比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

3組標本均有Hpa蛋白表達。子癇前期輕度及重度組蛋白含量明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.001），且子癇前期重度組與輕度組結果比較，差異有統計學意義（P<0.001），見表 2、圖 1。

表2 實驗各組Hpa的蛋白表達結果

3 討論

Hpa是一種能夠降解ECM和BM的主要組成成分HSPGs、側鏈乙酰肝素鹽及體內肝素的內源性葡萄糖醛酸內切酶，當其發揮生物學效應時可以破壞內皮細胞的完整性及加重子癇前期孕婦血液的高凝狀態[1]，并以此為契機引發體內一系列的病理生理活動。早在1976年Klein U等[4]科研小組就發現了Hpa這種能夠裂解ECM和BM中HSPGs、其側鏈乙酰肝素鹽及肝素的葡萄糖醛酸內切酶，但因純化過程較為困難，使其發展一度較為緩慢。直到1999年，3個研究小組分別從血小板、胎盤和黑色素細胞瘤中克隆出一段相同的基因，提示目前發現哺乳動物細胞只表達一種能夠降解肝素的酶即Hpa[5-6]。1999年，以色列科學家Vlodavsky I等[2]成功純化出Hpa蛋白并克隆出其基因，將人類Hpa基因定位于4q21.3，其相對分子量約為65 000，降解后分子量為50 000的蛋白片段具有活性。

Hpa能夠破壞血管內皮細胞。細胞膜和基底膜主要構成成分之一是糖氨聚糖，它的主要成分是HSPGs。HSPGs是一個由蛋白核心和數個與之共價連接的線性硫酸乙酰肝素側鏈組成[7-8]，對于細胞的完整性有至關重要的作用，Hpa通過酶解HSPGs及其側鏈[9]，可以破壞ECM和BM的完整性，同時，還可以釋放并激活各種與肝素結合的活性分子破壞血管內皮完整性，使血管內皮細胞就會出現功能障礙，同時內皮受損會釋放出大量的炎癥介質以及介導免疫反應的活性蛋白片段，使血管內皮源性舒張因子減少，而血管內皮收縮因子血栓素A2產生增加，導致血管收縮因子和舒張因子比例失調，致血壓升高[9]。同時Hpa裂解HSPGs所產生的一系列活性蛋白片斷和其裂解肝素及其衍生物所致的血液高凝狀態，使微小血栓形成，血管阻力增高，血壓升高；同時血栓形成，血運不暢，形成酸性環境，進一步激活Hpa活性，形成惡性循環。本實驗結果可見，Hpa在子癇前期輕度及重度孕婦胎盤中的蛋白表達明顯高于正常對照組，而子癇前期重度孕婦胎盤中的Hpa蛋白表達又明顯高于子癇前期輕度，這與血壓升高趨勢相同，由此推測，Hpa與子癇前期患者血壓升高可能具有相關性。

Hpa破壞肝素與抗凝血酶Ⅲ的結合位點，阻礙肝素發揮抗凝作用[10]，致血液處于高凝狀態[11]。在以往研究發現，先兆子癇患者血清中基礎肝素水平及抗凝活性比正常孕婦下降50%[1]，這與本實驗Hpa的變化趨勢是一致的。子癇前期的孕婦，血壓升高，胎盤小血管痙攣，血流量減少；血液高凝，胎盤血液流速減慢，易形成微小血栓，氣體交換受到影響，胎兒供氧不足，致胎兒生長受限，胎兒窘迫，嚴重時會導致胎死宮內。而同時，供氧不足所致的酸性環境更加激活了Hpa的活性，形成惡性循環，導致嚴重并發癥。本實驗所選病例子癇前期組胎兒窘迫4例，胎死宮內1例，胎盤早剝1例，正常對照組胎兒情況基本正常。因本實驗樣本量有限，故Hpa與子癇前期孕婦并發癥之間的相關性有待進一步研究證實。

Hpa酶解HSPGs破壞血管內皮后，產生的縮血管物質增加，血壓升高，腎小球毛細血管痙攣，腎血流量減少，致腎缺血缺氧；Hpa降解HSPGs及HS，而HSPGs及HS是腎小球濾過膜電荷篩的主要成分，被降解后，大量陰離子丟失，腎小球濾過屏障電荷篩被破壞，即腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）多陰離子丟失，纖維蛋白沉積，內皮細胞腫脹、管腔變窄，加重腎臟的缺血缺氧；腎小球毛細血管內凝血，微血栓形成，導致腎小球萎縮，引起腎損害。腎臟上述變化可致腎小球基底膜滲透性增高，血漿蛋白自腎小球漏出，腎小管重吸收功能不全而出現蛋白尿[12]。實驗所選子癇前期患者依據人民衛生出版社出版的第七版《婦產科學》中子癇前期的定義，患者的尿蛋白為陽性，正常對照組尿蛋白為陰性，其中，子癇前期輕度（+），子癇前期重度組患者（++）～（++++），總體趨勢與Hpa變化一致。故Hpa蛋白表達含量增加可能是蛋白尿的產生原因之一，這點與文獻報道一致[13]。

綜上所述，Hpa在子癇前期孕婦胎盤中的蛋白表達水平增高可致孕婦體內肝素水平下降及血管內皮損傷，推測與妊娠期高血壓疾病的發生、發展有關。隨著人們對這一物質的認識深入，其在婦產科其他領域的作用也在逐步被發現。

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