醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶A1的研究

時敏，周曉丹，李越，李志平，于殿宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶A1的研究

時敏，周曉丹，李越，李志平，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

以醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜為載體對磷脂酶進行吸附固定，以酶活力為指標，進行單因素實驗，并采用響應(yīng)面的方法進行分析，確定最佳的固定化條件為：酶液濃度0.06g/mL，吸附時間3h，溫度60℃，攪拌速度200r/min，得到固定后的酶活力為4.0U/cm2。由SEM結(jié)果可知，CA/PTFE復(fù)合膜可較好的固定磷脂酶。

醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜，固定化，磷脂酶A1，響應(yīng)面，SEM

磷脂酶A1（Lecitase Ultra）是一種羧酸酯水解酶，專一水解磷脂Sn-1位脂肪酸，生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂改性、油脂精煉等方面有廣泛應(yīng)用[1]。但是，游離磷脂酶A1價格昂貴，不易回收，催化水解時條件苛刻。而固定化磷脂酶A1具以下優(yōu)點：容易從產(chǎn)品中分離；在反應(yīng)器位置容易固定；穩(wěn)定性高，可長時間連續(xù)操作；保留活性高，并可獲得超高活性[2-3]。所謂固定化酶就是利用物理或化學(xué)方法處理，將游離酶限定或束縛于一定范圍之內(nèi)使其與整體流體分開，但仍能發(fā)揮催化作用的酶制劑[4-5]。現(xiàn)固定化酶在化學(xué)、生物學(xué)及生物工程、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展[6]。近年來，一些學(xué)者研究主要集中在固定化方法上[7]。目前已建立的固定化方法一般可分為：包埋法[8]、吸附法[9]、交聯(lián)法[10]及共價偶聯(lián)法等。目前，國內(nèi)外關(guān)于酶的膜固定化技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點領(lǐng)域[11-12]。但關(guān)于磷脂酶A1的固定化研究卻很少見。本實驗以醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜為載體固定磷脂酶，醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性好、疏水性、機械性能優(yōu)異等優(yōu)點。根據(jù)復(fù)合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)[13-14]。在該復(fù)合膜固定化磷脂酶的過程中，研究了酶液濃度、吸附時間、溫度和攪拌速度等不同固定化條件對磷脂酶固定化效率和催化效果的影響，并采用響應(yīng)面的分析方法，得到了最佳固定化條件并對其進行了驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶A1（Lecitase Ultra，酶活力6800U/g）諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；醋酸纖維素北京惠寶聯(lián)化科技有限公司；聚四氟乙烯膜（平均孔徑0.1μm，厚度85μm）北京塑料研究所；二甲基甲酰胺（DMF）天津市基準化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇（PVA）國藥集團化學(xué)試劑有限公司等。

手動薄層涂鋪器上海信誼儀器廠；DF-101S焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州金育科貿(mào)有限公司；PHS-3C精密酸度計梅特勒-托利多儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合膜的制備將15g醋酸纖維素60℃下溶于85g DMF中得到鑄膜液。將PTFE基膜先用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，真空干燥后，平鋪在潔凈的玻璃板上。控制厚度，將CA鑄膜液用特制的刮刀涂在PTFE表面，在室溫下?lián)]發(fā)適當(dāng)?shù)臅r間完成干相轉(zhuǎn)換后，浸入去離子水完成濕相轉(zhuǎn)換。12h后用去離子水清洗，自然干燥待用。

1.2.2 磷脂酶的固定化取若干份1cm2的CA/PTFE復(fù)合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和pH5.0的磷酸氫二鈉/檸檬酸緩沖液，攪拌吸附一定時間。反應(yīng)結(jié)束后取出酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待其風(fēng)干后測定酶活。

1.2.3 游離酶酶活力的測定[15]一定量的底物無油磷脂、0.5%PVA溶于預(yù)定pH5的緩沖液中，經(jīng)磁力攪拌器充分攪拌，混合均勻，得到4%底物溶液。取4個100mL三角瓶，2個作為空白瓶，2個作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95%乙醇15mL，于預(yù)定溫度的水浴中預(yù)熱5min，然后在各瓶中加入用緩沖液稀釋10倍的Lecitase Ultra酶液1mL，立即混勻計時，在預(yù)定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準確反應(yīng)15min，然后于樣品瓶中立即補加95%乙醇15mL終止反應(yīng)，取出，用微量滴定管和配制好的NaOH標準溶液滴定，計算標準堿液平均消耗量。式中：X——樣品的酶活力，U/cm2；V——滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液體積，mL；V0——滴定空白時消耗的NaOH標準溶液體積，mL；c——NaOH標準溶液的濃度，mol/L；50——0.05mol/L NaOH標準溶液1.00mL相當(dāng)于脂肪酸0.05μmol；n——酶液樣品的稀釋倍數(shù)；t——測定酶活時的反應(yīng)時間，min。

1.2.4 固定化酶活力的測定取1cm2的固定化酶膜，按照游離酶酶活力的測定方法進行相應(yīng)的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響固定化的單因素分析

2.1.1 酶液濃度的影響分別在不同酶液濃度的磷酸鹽緩沖溶液中對醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜進行吸附固定，吸附時間3.5h，溫度55℃，攪拌速度200r/min，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出當(dāng)酶液濃度為0.05g/mL時酶活力最大，這是因為磷脂酶在吸附固定化時，載體吸附的酶量是有限的，一方面可能是載體的吸附能力較低，使載體可吸附的酶量較少，催化活性較低；另一方面即使載體吸附性較強，但吸附的蛋白質(zhì)過多，造成酶分子相互聚集導(dǎo)致磷脂酶的活性中心互相遮蓋，導(dǎo)致酶的催化活性低。因此，本實驗的最適酶液濃度為0.05g/mL。

2.1.2 吸附時間的影響當(dāng)磷脂酶的濃度為0.05g/mL時，分別選取不同的吸附時間對醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜進行吸附固定，溫度55℃，攪拌速度200r/min，結(jié)果如圖2所示。

圖2 吸附時間對固定化酶活的影響Fig.2Effect of adsorption time on activity of immobilized lipase

從圖2可以看出醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜在吸附時間為3h時酶活力最大，當(dāng)吸附時間低于3h時固定化酶活隨著吸附時間的增大而增加，而高于此值后固定化酶活呈下降趨勢，這是因為隨著固定化時間的延長，單位載體上吸附的酶過多而使孔道堵塞，從而影響酶活。因此，本實驗的最適吸附時間為3h。

2.1.3 溫度的影響當(dāng)磷脂酶的濃度為0.05g/mL、吸附時間為3h時，攪拌速度200r/min，分別在不同溫度條件下對醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜進行吸附固定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對固定化酶活的影響Fig.3Effect of temperature on activity of immobilized lipase

從圖3可以看出當(dāng)溫度為60℃時效果最好，酶活力最大。這是因為溫度過低不利于酶分子和載體分子接觸，而隨著溫度的升高，可能引起酶分子的變性甚至失活。因此，本實驗選取的最適溫度為60℃。

2.1.4 攪拌速度的影響當(dāng)磷脂酶的濃度為0.05g/mL、吸附時間為3h、溫度為60℃時，選取80~280r/min不同轉(zhuǎn)速進行吸附固定，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出當(dāng)攪拌速度為200r/min時效果最好，酶活力最大，這是因為一定的攪拌速度可以使酶分子和載體分子充分的接觸，有利于酶分子進入載體分子的孔隙中，完成固定化過程，因此，本實驗采取的最適攪拌速度為200r/min。

2.2 回歸方程的建立與分析

由單因素實驗可以看出在磷脂酶的固定化過程中，反應(yīng)酶液濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對酶活力影響較大，而攪拌速度對酶活力影響不大，因此確定反應(yīng)酶液濃度為0.05g/mL，反應(yīng)時間為3h，反應(yīng)溫度為60℃，在此基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計（Box-Benhnken）[16]，以酶液濃度（A）、吸附時間（B）和溫度（C）為自變量，酶活力（R1）為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗。自變量水平編碼見表1，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表Table 1Code of factors and levels

利用Design Expert 7.0.0軟件對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3（p<0.05為顯著項）。

通過對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到酶活力（R1）對自變量酶液濃度（A）、吸附時間（B）和溫度（C）的回歸方程為：

Y=4.09+0.026A-0.021B-0.10C+2.500×10-3AB+ 5.000×10-3AC+0.000BC-0.14A2-0.15B2-0.16C2

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p<0.0001）失擬項不顯著（p>0.05），并且該模型R2=98.88%，R2Adj=97.39%，說明該模型與實驗擬合良好，僅有約1.12%的響應(yīng)值的總變異不能用該模型表示。由表3還可以看出，磷脂酶的固定化過程中的A、C、A2、B2和C2為顯著影響因素，即酶液濃度、溫度、酶液濃度平方項、吸附時間平方項和溫度平方項為顯著因素。圖5~圖7分別給出了反應(yīng)的酶液濃度與吸附時間、反應(yīng)的酶液濃度與溫度和吸附時間與溫度的交互作用對酶活力的響應(yīng)曲面圖。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table2Designproposaland experimentresultofresponsesurface

由圖5可以看出，酶活力的極值出現(xiàn)在實驗范圍內(nèi)，在酶液濃度為0.05~0.06g/mL，吸附時間約為3h時，酶活力在4.0U/cm2以上。

由圖6可以看出，酶活力的極值出現(xiàn)在實驗范圍內(nèi)，在酶液濃度為0.05~0.06g/mL，反應(yīng)溫度約為55~ 60℃時，酶活力在4.0U/cm2以上。

由圖7可以看出，酶活力的極值出現(xiàn)在實驗范圍內(nèi)，在吸附時間為2.5~3.5h，反應(yīng)溫度為55~60℃時，酶活力在4.0U/cm2以上。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表4。

表3 方差分析結(jié)果Table 3The test results of variance analysis

圖5 酶液濃度與吸附時間交互影響對酶活力的響應(yīng)面圖Fig.5Contour plots and response surface of lipase concentration VS adsorption time

圖6 酶液濃度與溫度交互影響對酶活力的響應(yīng)面圖Fig.6Contour plots and response surface of lipase concentration VS temperature

圖7 吸附時間與溫度交互影響對酶活力的響應(yīng)面圖Fig.7Contour plots and response surface of adsorption time VS temperature

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果Table 4Results of response surface optimization

為檢驗響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進行實驗，得到的酶活力為4.0U/cm2。預(yù)測值與實驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性。表明所得出的回歸方程可以很好的反映酶液濃度、吸附時間和反應(yīng)溫度與酶活力的關(guān)系。因此響應(yīng)面分析法所得到的固定化條件參數(shù)準確可靠，在實踐中具有可行性。

2.3 SEM圖像的研究

如圖8所示，a、b、c、d分別為PTFE、PTFE固定化酶、CA/PTFE、CA/PTFE固定化酶表面結(jié)構(gòu)的SEM圖。由圖像對比可知：圖a中PTFE是多孔性結(jié)構(gòu)，開孔率比較高，因此有較大的空間來負載酶。圖b中用PTFE單膜來固定化磷脂酶，得到的圖像仍有少許孔隙可見，這說明PTFE膜表面只負載了部分磷脂酶。圖c中CA涂在PTFE表面制成CA/PTFE復(fù)合膜，CA/PTFE復(fù)合膜表面較致密，生物兼容性好，穩(wěn)定性好。圖d中CA/PTFE復(fù)合膜表面的微孔大部分被酶覆蓋，且酶堆積的非常致密，表明大部分酶滯留在CA和PTFE的界面上，這種結(jié)構(gòu)較利于磷脂酶的固定化。

圖8 SEM圖像Fig.8SEM images

3 結(jié)論

3.1 本實驗以醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜為載體對磷脂酶進行吸附固定的研究。由單因素及響應(yīng)面分析得到最佳的固定化條件為：酶液濃度0.06g/mL，吸附時間3h，溫度60℃，攪拌速度200r/min，得到固定后的酶活力為4.0U/cm2。

3.2 SEM結(jié)果顯示：CA/PTFE復(fù)合膜表面的孔隙大部分被酶覆蓋，且酶堆積得非常均勻，表明大部分酶滯留在CA/PTFE的界面上，這種結(jié)構(gòu)較利于磷脂酶的固定化。

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Study on phospholipase A1immobilized by CA/PTFE composite membrane

SHI Min，ZHOU Xiao-dan，LI Yue，LI Zhi-ping，YU Dian-yu*
（School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The phospholipase was immobilized on the cellulose acetate（CA）/polytetrafluoroethylene（PTFE）by adsorption.The single-factor tests of immobilization condition were made though investigateing lipase activity，then the results were optimized by the response surface methodology.The optimal condition of the immobilization was as follows：phospholipase concentration 0.06g/mL，adsorption for 3h，adsorption temperature at 60℃，oscillation velocity 200r/min，the activity of immobilized lipase reached 4.0U/cm2.From the results of SEM，phospholipase were well immobilized by the CA/PTFE.

CA/PTFE composite membrane；immobihzation；phospholipaseA1；response surface；SEM

TS201.2

A

1002-0306（2012）13-0127-05

2011－09－26*通訊聯(lián)系人

時敏（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食油脂加工。

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃油脂非均相反應(yīng)和多相分離精制技術(shù)（2010AA101503）；國家十二五科技支撐計劃大豆油加工關(guān)鍵技術(shù)和裝備研究與示范（2011BAD02B01）。

圖4攪拌速度對固定化酶活的影響

Fig.4Effect of stirring rate and on activity of immobilized lipase

Vol.33,No.13,2012