PEG-（NH4）2SO4雙水相提取蜂膠黃酮

畢玉芬，戴 云，雷 雨，丁仲娟，丁永真

（1.昆明醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院，云南昆明 650021；2.云南民族大學(xué)，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650521）

PEG-（NH4）2SO4雙水相提取蜂膠黃酮

畢玉芬1，2，戴 云1，雷 雨1，丁仲娟2，*，丁永真1

（1.昆明醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院，云南昆明 650021；2.云南民族大學(xué)，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650521）

建立了PEG-（NH4）2SO4雙水相提取蜂膠中總黃酮的方法，并利用CCD-RSM優(yōu)化提取條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察PEG濃度、硫酸銨用量、pH 3個(gè)因素對(duì)蜂膠黃酮得率的影響。結(jié)果表明：最佳提取條件為：在PEG濃度為13.3%，pH為6.4，硫酸銨用量18.8%時(shí)，總黃酮提取率可以達(dá)到97.28%，該工藝具有價(jià)廉、簡(jiǎn)單快速、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

蜂膠，雙水相分離，總黃酮，響應(yīng)面分析法，提取率

Abstract：The method of PEG-（NH4）2SO4two-phase system was built preliminarily to extract the total of flavonoids in propolis.The CCD-RSM was used to optimize the conditions.On base of single factor optimization，the PEG concentration，ammonium sulfate dosage and pH were investigated to detect the effect of flavonoids in propolis.The results showed that the optimal extraction conditions：PEG concentration 13.3%，and the pH6.4，ammonium sulphate content 18.8%，flavonoids extraction rate 97.28%.This method has many advantages，including priceless，simple，rapid and friendly to environment，etc.

Key words：propolis；two-aqueous phase；flavonoids；response surface methodology；extraction yield中圖分類號(hào)：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1002-0306（2012）13-0205-04

雙水相萃取技術(shù)（two-aqueous phase extraction，TAPE）是一種利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取的新型液-液萃取技術(shù)。TAPE法和傳統(tǒng)的分離方法（如鹽析、沉淀、有機(jī)溶劑萃取等）相比其優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、溶劑用量少3～10倍、不存在有機(jī)溶劑殘留、分相時(shí)間短，且TAPE體系具有價(jià)廉、低毒、較易揮發(fā)而無(wú)需反萃取和避免使用粘稠水溶性高聚物等特點(diǎn)，因此近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、天然活性產(chǎn)物等領(lǐng)域[1-4]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）是在兩水平析因的基礎(chǔ)上增加極值點(diǎn)和中心點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)方法[5]，響應(yīng)面優(yōu)化法（Response Surface Method，RSM）是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平因素進(jìn)行連續(xù)分析，進(jìn)而尋找最佳實(shí)驗(yàn)條件的方法[6-7]。蜂膠中富含的黃酮類物質(zhì)具有多方面的生理與藥理作用，因此引起了研究人員的廣泛興趣。目前國(guó)內(nèi)對(duì)蜂膠黃酮的各種提取、分離分析方法已有許多報(bào)道[8-9]，但還未見(jiàn)到利用PEG-（NH4）2SO4雙水相提取蜂膠中總黃酮并用CCD-RSM優(yōu)化提取條件的方法報(bào)道。本文研究了聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取蜂膠總黃酮的方法，并利用CCD-RSM對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為蜂膠資源的深入研究提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南產(chǎn)蜂膠 昆明醫(yī)學(xué)院提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)10008；5%NaNO2溶液，10%Al（NO3）3溶液，4%NaOH溶液；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

AS3120A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI；恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PEG-（NH4）2SO4雙水相體系的形成[10]準(zhǔn)確稱取一定的PEG和硫酸銨于25mL比色管中，定容至刻度，確保溶液混合后分相，即得到25mL的PEG和硫酸銨雙水相體系溶液。

1.2.2 蜂膠總黃酮的提取和測(cè)定

1.2.2.1 蜂膠樣品制備 蜂膠原料脫蠟和粗提取參照文獻(xiàn)[11]。濃縮，再準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量配制成100mL溶液待用。

1.2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.2.3 蜂膠總黃酮測(cè)定[13]準(zhǔn)確移取一定濃度的蜂膠溶液，加入25mL PEG和硫酸銨雙水相體系溶液，溶液充分混合，靜止分相。總黃酮測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，在波長(zhǎng)為510nm下測(cè)定。

1.2.2.4 蜂膠提取率計(jì)算[14]提取率測(cè)定按下式計(jì)算：

其中：R—雙水相體系上下層的體積比；K—雙水相體系的分配系數(shù)；Y—蜂膠在上層中的萃取率；Vu—上相體積，mL；Vd—下相體積，mL；Cu—上相物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；Cd—下相物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

考察聚乙二醇濃度、硫酸銨用量、pH和溫度4個(gè)因素對(duì)蜂膠總黃酮提取效果的影響。

1.4 編碼設(shè)計(jì)[15]

本文選擇聚乙二醇濃度、硫酸銨用量、pH作為本次實(shí)驗(yàn)的主要影響因子，設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素水平分布，如表1所示。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Levels and factors of the experiment assignment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 聚乙二醇濃度的確定 準(zhǔn)確移取7份1.2.2.1制備蜂膠溶液各3mL，分別置于25mL比色管中，固定（NH4）2SO4濃度為16%，pH為7，聚乙二醇濃度變化范圍為8%～18%，以2%為梯度變化，考察不同聚乙二醇濃度對(duì)蜂膠總黃酮提取效果的影響。

圖1 不同PEG濃度對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響Fig.1 Different PEG concentration on the influence of flavonoids extraction from propolis

如圖1所示，隨著PEG濃度的增加，蜂膠總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)PEG濃度達(dá)到12%時(shí)，蜂膠總黃酮提取率為最大值，當(dāng)大于12%時(shí)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故選擇PEG濃度為12%。

2.1.2 硫酸銨用量的確定 準(zhǔn)確移取5份1.2.2.1制備蜂膠溶液3mL，分別置于25mL比色管中，固定PEG6000濃度為12%，pH為7，硫酸銨用量范圍為12%～20%，變化梯度2%，考察不同硫酸銨用量對(duì)蜂膠總黃酮提取效果的影響。

圖2 不同硫酸銨用量對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響Fig.2 Different dosage of ammonium sulfate on the influence of flavonoids extraction from propolis

如圖2所示，隨硫酸銨用量的增大，蜂膠總黃酮提取率逐漸增大，硫酸銨用量為16%時(shí)，提取率最大。但用量超過(guò)16%后，反而使蜂膠總黃酮提取率下降。故硫酸銨用量為16%。

2.1.3 pH范圍的確定 準(zhǔn)確移取7份1.2.2.1制備蜂膠溶液3mL，分別置于25mL比色管中，固定PEG6000濃度12%，（NH4）2SO4濃度16%，pH變化范圍為2～10，梯度為2，考察不同pH對(duì)蜂膠總黃酮提取效果的影響。

圖3 不同pH對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響Fig.3 Different pH value on the influence of flavonoids extraction from propolis

如圖3所示，隨pH增加，蜂膠總黃酮提取率增大，但pH達(dá)到一定程度時(shí)，蜂膠總黃酮提取率最大。當(dāng)pH為6時(shí)，蜂膠總黃酮提取率基本達(dá)到最大值。

2.1.4 溫度的確定 準(zhǔn)確移取4份1.2.2.1制備蜂膠溶液3mL，分別置于25mL比色管中，固定PEG6000濃度12%，（NH4）2SO4濃度16%，pH為7，考察溫度在15、25、35、45℃時(shí)對(duì)蜂膠總黃酮提取的影響，結(jié)果表明：溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程影響不大，且考慮到該工藝是緩釋藥物制備的前期工作，故溫度選擇在室溫下進(jìn)行。此外，基于合作單位研究組考察后已確定選用PEG6000為載體，本研究組選擇PEG6000為載體

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果[16]

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以聚乙二醇濃度、硫酸銨用量、pH三個(gè)因素為自變量X1、X2、X3，總黃酮得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中14個(gè)析因點(diǎn)，6個(gè)零點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

2.3 回歸模型

以蜂膠總黃酮的提取率為響應(yīng)值，對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y和各因子之間的二次回歸方程（R2=0.9995）：

Y=99.88-0.82X1-0.34X2-0.40X3-0.44X1X2+1.46X1X3-0.10X2X3-3.17X12-2.15X22-2.20X32

該方程p＜0.001，所以該模型是顯著的，可用來(lái)預(yù)測(cè)聚乙二醇-硫酸銨雙水相萃取體系提取蜂膠中總黃酮物質(zhì)的最佳提取工藝。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experiment design and the results

2.4 方差分析

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表3中統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)給出了線性項(xiàng)、二次項(xiàng)、以及交互項(xiàng)對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響，所有二次項(xiàng)以及交互項(xiàng)中，線性項(xiàng)和二次項(xiàng)的p值均小于0.001，說(shuō)明影響差異極顯著，二次項(xiàng)中，PEG濃度與硫酸銨用量的交互作用（p＜0.001）和硫酸銨用量與pH的交互作用（p＜0.001）對(duì)模型具有差異極顯著性，而硫酸銨用量與pH的交互作用的p＜0.05，表現(xiàn)差異顯著。

2.5 響應(yīng)面分析

保持三個(gè)變量中的一個(gè)不變，得到PEG濃度、硫酸銨用量和pH之間其他兩個(gè)因素之間的三維響應(yīng)面曲線，見(jiàn)圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface（3D）showing the effect of PEG concentration（X1），Ammonium Sulfate（X2）and pH（X3）on the response value of general flavonoids yield

圖4a～c為PEG濃度X1、硫酸銨用量X2、pH范圍X3對(duì)響應(yīng)值云南產(chǎn)蜂膠提取率Y的響應(yīng)圖。由圖a可看出，在X1、X2因素方向，取值相對(duì)較小時(shí)，響應(yīng)面曲線明顯較陡，說(shuō)明X1、X2因素取值相對(duì)較小時(shí)對(duì)響應(yīng)值Y蜂膠總黃酮提取率的貢獻(xiàn)大；圖b中，在X1、X3因素方向，取值相對(duì)較大時(shí)，響應(yīng)面曲線明顯較陡，表明取值相對(duì)較大時(shí)其相互間的交互作用對(duì)響應(yīng)值Y蜂膠總黃酮提取率的影響大；圖c表明，當(dāng)X2、X3取值較小時(shí)，響應(yīng)面曲線較陡，說(shuō)明X2、X3取值較小時(shí)其相互間的交互作用對(duì)響應(yīng)值Y的影響更大。綜合考慮X1與X2和X3的交互作用（圖a、b），X1值較大時(shí)對(duì)響應(yīng)值Y蜂膠總黃酮提取率的貢獻(xiàn)大；X2與X1和X3交互作用（圖a、c），則X2值較大時(shí)對(duì)響應(yīng)值Y蜂膠總黃酮提取率的貢獻(xiàn)大；X3與X1和X2交互作用（圖b、c），則X3值較小時(shí)對(duì)響應(yīng)值Y蜂膠總黃酮提取率的貢獻(xiàn)大。

結(jié)合顯著性分析可知，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)響應(yīng)值Y的影響排序，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響順序是：X1（PEG濃度）＞X3（pH）＞X2（（NH4）2SO4用量），PEG濃度與（NH4）2SO4用量，PEG濃度與pH，（NH4）2SO4用量與pH對(duì)響應(yīng)值蜂膠中總黃酮提取率Y存在交互作用，說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非簡(jiǎn)單的線性加合關(guān)系。

2.6 條件優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

利用Design-Expert Software 7.0的Optimization Choices模塊，進(jìn)行數(shù)字優(yōu)化，可獲得一組響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件：PEG濃度為13.3%，pH為6.4，硫酸銨用量18.8%，總黃酮提取率為97.68%，參照理論上的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：提取率平均值Y=97.28%（n=5，R=0.16%），與理論提取率接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立了用PEG-（NH4）2SO4雙水相體系提取蜂膠粗物中總黃酮的方法，該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，能充分考慮各因素間的相互作用，采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，與預(yù)測(cè)值基本相符，蜂膠總黃酮的提取率可達(dá)97.28%；該方法價(jià)廉低毒、簡(jiǎn)便易行，同時(shí)提高了蜂膠總黃酮得率，有較好的應(yīng)用前景。

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Flavonoids extraction from propolis with PEG-（NH4）2SO4two-phase system

BI Yu-fen1，2，DAI Yun1，LEI Yu1，DING Zhong-juan2，*，DING Yong-zhen1
（1.The Affiliated Stomatology Hospital，Kunming Medical University，Kunming 650021，China；2.Key Laboratory of Ethnic Medicine Resources Chemistry，State Ethnic Affairs Commisson&Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650521，China）

2011－11－17 *通訊聯(lián)系人

畢玉芬（1985－），女，在讀研究生，研究方向：有機(jī)分析。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30471225）；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAD27B09；2006BAD04A12）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA10Z320）。