指紋圖譜技術在乳制品質量控制中的應用

樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國譜

（湖南亞華乳業有限公司，湖南長沙410200）

指紋圖譜技術在乳制品質量控制中的應用

樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國譜*

（湖南亞華乳業有限公司，湖南長沙410200）

指紋圖譜技術是一種分析復雜組分或成品的有效、全面的分析方法。簡要地介紹了指紋圖譜技術的特點、研究方法以及指紋圖譜的構建。重點概述了指紋圖譜技術在乳制品領域中的應用，包括特征鑒定、摻假識別、質量過程控制以及微生物監測四個方面。指紋圖譜技術將成為乳制品質量控制新的發展方向。

乳制品，指紋圖譜，質量控制，應用

Abstract：The technology of fingerprint is an effective means to analyze the complex components and products.The characteristics，the research methods and the construction theory of the fingerprint technology were introduced briefly.Application of fingerprint technology in dairy production was discussed emphatically，including flavor characterization，adulteration identification，and quality control of processing and monitoring of microbiology.Fingerprint Technology will be a new development for dairy production quality control.

Key words：dairy production；fingerprint；quality control；application

牛奶是嬰幼兒早期除母乳外的唯一來源，其質量關系到孩子的生命安全。然而近年來，一些因奶粉質量問題而引發的事件層出不窮，如安徽阜陽的“毒奶粉”事件，“三聚氰胺奶粉事件”，圣元的“激素門”，以及最近的“皮革奶”等。因此，迫切需要生產企業建立有效的檢測手段和有力的質量保障體系，提供更優質、安全、放心的乳制品。目前奶粉的鑒別方法主要有肉眼等感官鑒別法、化學分析法、中紅外光譜分析法、紫外線吸收光譜法、近紅外光譜分析法、超聲波檢測法等[1]。但是這些方法大多存在不足，一般只是測定乳制品中的單個組分或幾個組分，不能將多個組分同時進行測定，難以從本質上、宏觀上、整體上綜合分析乳制品的質量。指紋圖譜技術是一種快速、有效、全面的測定方法，強調的是圖譜的完整面貌即整體性，反映的質量信息是綜合性的。特別是在復雜體系中，指紋圖譜能客觀反映事物的全貌，是單一指標成分鑒定方法不可比擬的。不同地域的原料乳或不同廠家生產的乳制品都具有各自獨特的風味組成以及所含菌落的差異性，以區別于其它產品，即有自己獨一無二的“指紋特征”。本文借用中藥、白酒、香料等成熟的指紋圖譜技術，探索指紋圖譜技術在乳制品質量控制中的應用。與單一成分作為控制指標的質量方法相比，指紋圖譜可以很好地適應乳制品成分復雜的特點。指紋圖譜技術不僅可以評價乳制品的真偽與優劣，也可以判斷乳制品質量的穩定性以及制備工藝的合理性。

1 指紋圖譜技術的特點

指紋圖譜技術是指樣品經適當的預處理后，采用一定的分析方法，得到能夠顯示該樣品特性的譜圖，這些圖譜就像人的指紋一樣具有專一性和代表性，且盡可能多地反映樣品的全貌，所以被稱之為指紋圖譜。

其特點在于：特征性和專屬性：通過指紋圖譜能有效鑒別樣品的真偽或產地；可量化性：由主要特征峰的面積或比例，能有效控制樣品質量，確保樣品質量的相對穩定；穩定性、重現性和再現性：由圖譜采集環境或者分析測試手段決定；有效性：這應與產品相聯系，并且在統計學上其數據有鑒別意義；完整性：表現多成分之間的相互關系；模糊性：成分間的協同交互作用復雜，故采用模糊數學的分析手段解決實際問題[2]。

2 指紋圖譜技術的研究方法

指紋圖譜技術的研究方法主要包括：色譜法：傳統的薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法和高效毛細管電泳法等；光譜法：紫外光譜法和紅外光譜法等；波譜法：質譜法和核磁共振法等；其他方法：如X射線衍射法，分子生物學方法等[3]。其中色譜法是公認的應用最廣也是最成熟的指紋圖譜技術的研究方法。

氣相色譜法（GC）主要用于分析氣體、揮發性和半揮發性液體以及能夠產生足夠蒸汽壓的固體，或者沸點在500℃以下，相對分子質量400u以下的物質。GC的特點是靈敏度高、分離度好、分析速度快[4]。

高效液相色譜法（HPLC）是一種具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速的分離分析技術。它給出的是高分辨率的輪廓圖譜，重現性好、操作相對容易、在線操作外界影響因素小、色譜穩定性好，是目前指紋圖譜研究應用最多的一項技術[5]。

DNA指紋圖譜技術屬于分子生物學方法的范疇，可用于鑒別產品的真偽。由于同種生物體具有相同的DNA序列，生物的不同個體或不同種群在DNA結構上存在著差異，可依據此來鑒定生物物種。隨著微量DNA提取技術和PCR擴增、RAPD隨機擴增標記技術的發展，使DNA的提取更加便捷準確。在分子水平上檢測基因多態性，比形態、組織和化學水平上檢測結果更加準確可靠。

3 指紋圖譜的構建

指紋圖譜的構建步驟為：

a.樣品采集：考慮到樣品批次不同所導致的差異，要在一定數量的樣品中，選擇合適數量的樣品進行檢測。一般要求至少六個批次的標準樣品進行檢測，把獲取的原始圖譜（圖像）進行平均，得出標準圖譜[6]。

b.圖譜數據的采集：樣品經過或不經過預處理，選取適當的方法建立指紋圖譜，進一步確定該方法所對應的各項參數。例如，采用色譜法進行指紋圖譜分析，則要確定進樣方式和進樣量以及所使用的色譜條件，包括色譜柱的選擇、載氣、溫度、流速、質譜條件等[7]。

c.數據分析：對獲得的圖譜進行比較分析，尋找分離好、分辨率高、重現性好的圖譜，進行圖譜辨認和評價，找出具有規律性的“共性”和“個性”。常用的數據分析方法有：直觀比較法、量化數據比較法、化學模式識別法、計算機軟件分析等[8]。

4 指紋圖譜技術在乳制品中的應用

4.1 特征鑒定

不同區域的原料乳或不同品牌的乳制品，由于地理分布、氣候條件等環境因素的不同和地域文化特征的差異，其中所含揮發性物質的含量和比例以及所含菌落的多樣性和差異性也不盡相同。它們的指紋圖譜會表現出相同的特征，也就是共性部分，當然也會有部分指紋圖譜的表現不同，這就是決定原料乳或成品獨有的個性部分，需經鑒別系統進行進一步的識別。不同的地區或不同的奶源基地可以建立各地收奶地區的指紋圖譜庫，以表現不同的地方特色，而且不同產地的原料乳或成品將組成全國的乳制品指紋圖譜庫。

據報道采用固相微萃取-氣相色譜-頂空-質譜（SPME-GC-HS-MS）法，不經前處理，可直接對奶油進行分析，其質量指紋圖譜既可用于鑒別進口新西蘭天然奶油，也可用于鑒別不同生產國所生產的天然奶油[9]。

C Fernandez等人分別于春夏冬三季在法國的高原地帶（奧弗涅山脈）和較低地區（布列塔尼半島）共收集有代表性的原料乳樣品35個。乳脂肪中提取的單萜烯類和倍半萜類物質采用頂空氣質聯用法定量，通過多因辨別分析將原料乳樣品分類。發現奧弗涅高地的原料乳較布列塔尼半島含有更多的倍半萜，全部樣本按照原產地域正確歸類，不受其季節性畜群管理模式的影響。根據地域范圍和生產條件，通過萜烯混合物可以得到有價值的乳制品特征指紋圖譜[10]。

I Bonizzi等人通過16S-23S ITS-PCR技術，建立了高山牧場、低地牧場所產原料乳中微生物群落的指紋圖譜，該指紋圖譜可表現生物多樣的特征。結果表明生產意大利干酪的阿爾卑斯山地區的原料乳包含了各種各樣的細菌群落，而細菌群落的組成與牧場的海拔有關[11]。

4.2 摻假識別

部分奶農或奶站為牟取暴利，添加三聚氰胺、皮革蛋白等以次充好，以假亂真，利用指紋圖譜技術可以有效打擊乳制品的制假售假。首先，根據季節等外界因素的不同，選取足夠多的樣本，以其出峰的先后順序及相對含量的多少為特征，建立本地區穩定的原料乳基礎指紋圖譜庫；其次，以基礎指紋圖譜庫為參照，將被鑒別的樣本指紋圖譜與基礎指紋圖譜庫進行對比，根據出峰數量、保留時間、峰形大小等參數對圖譜進行定性識別，尋找是否存在差異的未知峰；最后，參數吻合則為合格，如果存在差異峰則需進一步的深入研究，選取合適的內標物應用質譜將未知峰定性。

曾慶方等人通過建立牛奶的HPLC-MS指紋圖譜，提取原料奶的特征信息，在樣品分析后的特征信息中扣除本底數據庫中已有的參考值，對異常參數值進行分析、確證，找出異常化合物。HPLC-MS指紋圖譜技術應用于牛奶中有害藥物篩查，較之用單一成分或指標監控，其質量更具有科學性、全面性和可追溯性，也從根本上解決了其他現有分析技術必須多種方法結合使用以及多項指標必須同時檢測才能對其質量合格與否做出判斷的弊端，大大提高了質量控制和評價的技術水平和科技含量[12]。

王顏紅等人采用高效液相色譜質譜聯用技術，建立了原料奶指紋圖譜，在一定程度上客觀反映了原料奶的整體質量特征。在此基礎上，選取有代表性有害物如防腐劑苯甲酸等進行了標準添加，建立了危害物的標準添加圖譜，對沈陽地區超市的50個純牛奶樣品進行了篩查，取得初步應用結果，為原料奶的質量控制和奶制品中有害物篩查體系的研究提供了方法學參考[13]。

4.3 質量的過程控制

在保證了上游奶源質量安全的基礎上，指紋圖譜技術同樣也可以應用在乳制品質量過程控制和出廠檢驗。指紋圖譜的特征可以反映半成品或成品內在質量的均一性和穩定性，又能表現各批次間的差異性，是判定原輔料及產成品質量穩定的重要手段。因此，乳制品生產企業可以建立自己的指紋圖譜數據庫，以此來指導生產、優化工藝、降低成本、實現利潤最大化。

袁潔等人認為指紋圖譜相似度是利用色譜流出曲線中保留時間對色譜峰進行匹配，然后對匹配峰進行比值計算，綜合計算出圖譜之間的相似度，從而實現對樣品差異程度的評價。既可評價產品批次間的穩定性，又可評價產品之間的差異性，具有直觀、全面的優點[14]。

I Proudy等人收集并歸類了200個分離的阪崎腸桿菌，其中70%表現出相同的指紋圖譜，表示在生產環境中有阪崎腸桿菌的存在。此方法可用于發現干混營養素方法生產的嬰兒配方奶粉中微生物的污染，同時，可實現一系列其他的控制管理，以減少最終產品受阪崎腸桿菌的污染[15]。

J Banykó等人采用PCR分析提取分離的芽孢桿菌，單引物定向擴增各物種的box重復序列作為特征序列，生乳和巴氏殺菌乳中所被污染的蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌種不同，而且乳制品生產過程中存在的一些BOX類型在原料乳中卻沒有。BOX-PCR指紋圖譜技術可以表征乳制品生產環境中桿菌的菌群，因此可用作證實環境是否被污染以及牛奶生產過程中桿菌的繁殖[16]。

4.4 微生物的檢測

通過指紋圖譜技術檢測乳制品中的乳酸菌，可實現乳酸菌組成及濃度的實時監測，進而反映產品質量的穩定性。此外，原料乳及乳制品在加工、運輸和流通等環節都有可能受到雜菌的污染，應用指紋圖譜技術可鑒定有害微生物菌種的組成、預測環境微生物可能存在的污染風險等。

李武等人利用PCR-DGGE指紋圖譜技術對市售某品牌酸奶進行了一個月的動態監測，共收集了6個生產批次的18個酸奶樣品，結合常規分離培養方法，對樣品微生物組成及其穩定性進行跟蹤監測。結果顯示所有供試樣品在整個動態監測期內DGGE指紋圖譜都出現2條帶，其微生物組成比較穩定，分別為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。通過菌種組成及其穩定性兩個指標對酸奶樣品質量進行評價，該技術可以作為酸奶質量控制和動態監測的快速、簡便的新方法[17]。

靳淼等人對引進直投型酸奶發酵劑（DVS）中乳桿菌進行分離鑒定，利用MRS半選擇性培養基對其進行分離，采用糖發酵實驗、全細胞蛋白電泳和RAPD指紋圖譜三種方法對其鑒定。結果表明，引進直投型酸奶發酵劑中乳桿菌由兩株菌構成[18]。

B E Gillespie等人使用聚合酶鏈反應為基礎的DNA指紋圖譜技術，將美國田納西州和新西蘭的牛乳房分泌物中分離出的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌進行分類。數據表明新西蘭的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌與美國田納西州截然不同，認為DNA指紋圖譜技術可以作為一個流行病學的工具，用來區分鏈球菌，同時可以鑒定農場中乳腺炎病原菌的來源[19]。

Robin M等人研究了脫脂乳粉、嬰兒配方奶粉、卵磷脂、可可粉等食品，每種食品的PCR指紋圖譜經過電泳分析，該譜帶與產腸毒素的芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA指紋圖譜有關。利用rep-PCR得到的DNA指紋圖譜不僅是確定細菌基因類型的工具，也是食品微生物學中質量控制和衛生監測的獨特方法[20]。

5 應用前景

隨著人們生活水平的提高，乳制品已經走進了千家萬戶，以其營養豐富、口味獨特、品種多樣等特點吸引著越來越多的消費者。面對如此龐大的乳制品消費市場，保證乳制品質量安全顯得非常重要。指紋圖譜技術對于乳制品這種特殊復雜的物質來說，可以實現多組分、多指標同時測定，在特征的鑒定，摻假的鑒別，質量的過程控制等方面應用較廣，真正實現從原料、配方到生產工藝及產成品全方位的穩定、可控。指紋圖譜技術在乳制品中的應用研究雖然起步較晚，但是從長遠來看，其將成為乳制品質量控制新的發展方向。

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Application of fingerprint technology in dairy production quality control

FAN Ping，ZHANG Ren-ming，HE Wu-ming，XIAO Lian-rong，REN Guo-pu*
（Hunan AVA Dairy CO.，Ltd.，Changsha 410200，China）

TS252.1

A

1002-0306（2012）13-0417-04

2011－05－18 *通訊聯系人

樊萍（1982-），女，碩士研究生，助理工程師，研究方向：農產品加工與儲藏。

長沙市重大專項（K1003191-21）。