響應面分析法優化超高壓提取柿葉單寧的研究

李 亮，顧熟琴，盧大新，楊 冬

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206）

響應面分析法優化超高壓提取柿葉單寧的研究

李 亮1，2，顧熟琴1，2，盧大新1，*，楊 冬1，2

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206）

在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法對柿葉單寧超高壓提取工藝進行優化。以總單寧得率為指標，考察固液比、提取溶劑濃度、壓力值、保壓時間對得率的影響。獲得最佳提取理論條件為：固液比為1∶25（g∶mL），溶液濃度為56.31%，壓力值為222.33MPa，保壓時間為3min，總單寧得率為96.19%。與溶劑提取法相比，本方法耗時短，效率高。

超高壓，柿葉單寧，溶液提取，響應面分析

Abstract：Based on single factor experiment，the optimal extraction conditions by ultra high pressure extraction process of persimmon tannin were described by response surface method，while the yield of tannins were adopted as indexes.Factors of solid-to-solution ratio，solution concentration，pressure value，and holding pressure time were evaluated for their effects on extraction process.The optimum conditions were as follows：solid-to-solution ratio of 1∶25，solution concentration of 56.31%，pressure value of 222.33MPa，holding pressure time of 3min.The proportion of total persimmon tannin was 96.19%under this conditions.It had time saving and high advantage compared with solvent extraction.

Key words：ultra high pressure；persimmon leaf tannin（PLT）；solvent extraction；response surface method

磨盤柿（Diospyros kakiL.f.cv.Mopan）是北京主栽優良柿品種，為澀柿品種，柿果形如磨盤，采收期在10月中旬，品質優良，在國內外均享有盛名。房山區栽培柿樹歷史悠久，全區現有磨盤柿8067hm2，占北京市柿樹總面積的70%。柿子葉中所含物質原料豐富，其中包含維生素C、單寧、蘆丁、膽堿、黃酮甙、類胡蘿卜素、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等多種對人體健康有益的營養成分[1]。雖然國內外對其他來源的單寧提取及應用有很多研究報道，但柿子葉中單寧的提取及應用卻鮮見文獻報道[2]。為充分利用現有的柿樹資源，開發高附加值的柿葉單寧產品，研究如何高效的提取柿葉單寧意義重大。目前，單寧提取較為常見的方法有兩種：一種是超聲波輔助提取法，另一種是鹽酸與乙醇的混合溶劑提取法[3-5]。超高壓技術作為食品行業非熱加工技術一直很受重視，也是一種提取植物原料中有效成分的高新技術。與傳統提取技術相比，超高壓具有提取時間短、能耗低、雜質少、“綠色”環保，且可避免因熱效應引起的有效成分結構變化、損失以及生理活性的降低[6-8]。因此，本文采用超高壓技術提取柿葉單寧，并應用響應面分析方法研究其提取工藝，分析不同溶液體積分數、超高壓壓力、加壓時間和固液比對總單寧得率的影響，并且同溶劑提取進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿葉 2010年10月采于北京房山區磨盤柿柿樹黃葉，室溫通風干燥后粉碎至60目、雙層密封袋置于恒溫恒濕箱中保存，在實驗前測定柿葉粉的含水量；單寧標準品 北京偉業科創科技有限公司單寧標準品（3G）；配制8g/L氨溶液，其他試劑均為分析純。

UHPF/3L/600MPa超高壓設備 包頭科發公司；UV9100D紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；VORTEX-5漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TD5A—WS臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓提取柿葉單寧方法 借鑒本超高壓實驗室超高壓處理通用方法，稱取一定量柿葉粉末裝入聚乙烯塑料瓶中（75mL），加入一定濃度的乙醇溶液，盡量排除瓶內空氣。用手握住塑料瓶振蕩5次，使其混合均勻。然后放入超高壓萃取釜內，設定條件。塑料瓶中的試樣在超高壓介質作用下，單寧滲出到乙醇溶液中。將超高壓處理后的懸濁液轉入離心管中，在3000r/min下離心10min，得到上清液。每個條件做三個平行，測定所得溶液中單寧含量，并計算其得率η。

式中：C1-提取液中的單寧濃度，mg/mL；V1-提取液的體積，mL；M-柿葉粉試樣的質量，g；ω-柿葉粉試樣中單寧的質量百分比。

根據所測提取液吸光度值，從測定的單寧標準曲線中讀取相應的濃度C1。

1.2.2 溶液提取柿葉單寧 根據溶劑提取單寧預實驗的正交分析結果，按固液比1∶25稱取一定量柿葉粉，加入100mL體積分數50%的乙醇溶液，在60℃恒溫下提取2.5h，將所得懸濁液倒入離心管，在3000r/min下離心10min，得上清液，并測定所得液中單寧含量[9-10]。做三次平行樣，計算其得率。

1.2.3 單寧標準曲線制定[11]用單寧標準品配標準溶液（2g/L）。用刻度移液管分別加0、1、2、3、4、5mL單寧酸溶液至20mL容量瓶中，用二甲基甲酚胺補充定容到刻度。得到單寧酸含量為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的標準溶液。

用移液管將上述溶液各取1mL移入試管，再加入5mL水及1mL檸檬酸鐵銨溶液，再用振蕩器振蕩5s，然后加1mL氨溶液再用振蕩器振蕩5s。將上述溶液移到測量杯中，靜置（10±1）min后，用分光光度計于525nm處測定吸光度。以水為空白對照。

用吸光度作縱坐標，用標準刻度上相對應的單寧酸濃度（mg/mL）作橫坐標，繪制標準曲線。所得標準曲線如圖1。

圖1 單寧標準曲線Fig.1 Standard curve of tannin

1.2.4 單寧含量的測量方法[11]采用分光光度計測定。用移液管取1mL被測溶液放入試管A中，接著用移液管加6mL水與1mL氨溶液，然后用振蕩器振蕩5s。用移液管取1mL被測溶液放入試管B中，接著用移液管加5mL水和1mL檸檬酸鐵銨溶液，用振蕩器振蕩5s，然后用移液管加1mL氨溶液，再用振蕩器振蕩5s。將A、B兩管靜置10min后，用分光光度計于525nm處測定各自的吸光度，用水做空白對照。A、B兩管吸光度之差即為所測溶液的吸光度，代入到標準曲線中計算出對應的濃度值。

1.2.5 單因素實驗 以固液比、溶液濃度、壓力值、保壓時間四因素為自變量，單寧得率為考量值，通過固定其他三個因素，改變某一因素的取值，確定相關因素的影響并為后續響應面實驗設計提供各個因素的取值范圍[12]。

1.2.6 響應面實驗 根據單因素實驗結果選定各個因素的零水平和波動區。以單寧得率為響應值，考慮超高壓壓力值、保壓時間、固液比、溶液濃度四因素，設計響應面實驗方案。通過Design-Expert軟件設計Box-Behnken Design（BBD）實驗[13]。實驗因素與水平的取值見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 溶液濃度對單寧得率的影響 在固液比1∶25，壓力值300MPa，保壓時間3min的條件下，乙醇溶液濃度對單寧得率的影響如圖2。

圖2 溶液濃度對單寧得率的影響Fig.2 Effects of solution concentrations on extraction rate

從圖2可以看出，隨溶液濃度的增大，單寧得率先增加后減小。當乙醇濃度達到60%時，單寧得率最高；當乙醇濃度再增加時，單寧得率反而下降。因此乙醇濃度控制在60%左右比較適宜。

2.1.2 壓力對單寧得率的影響 在固液比1∶25，保壓時間3min，乙醇濃度60%的條件下，分別以100、200、300、400、500MPa提取單寧，測得不同條件下所得單寧得率變化如圖3。

如圖3所示，當壓力低于200MPa時，單寧得率隨著壓力值增高有所上升。當壓力值到達200MPa后，單寧得率隨著壓力值的升高呈下降趨勢。原因是在200MPa以下超高壓處理時，3min內柿葉細胞的結構還沒有被破壞，乙醇溶液借助高壓滲透進入細胞內萃取出單寧分子，當處理的壓力值超過200MPa后，細胞壁及細胞膜無法承受3min的超高壓力而被破壞，許多雜質滲出影響了單寧分子的提取[14]。

圖3 壓力值對單寧得率的影響Fig.3 Effect of pressure value on extraction rate

2.1.3 保壓時間對單寧得率的影響 在固液比1∶25，壓力值300MPa，溶液濃度60%的條件下，保壓時間分為1、2、3、4、5min下的單寧提取，結果如圖4。

圖4 保壓時間對單寧得率的影響Fig.4 Effect of holding pressure time on extraction rate

從圖4可以看出，0～2min單寧得率隨保壓時間上升而增高，保壓時間2min之后單寧得率開始下降，在3min之后，得率基本沒有變化?？赡苁潜簳r間達到3min時，細胞組織已經無法承受超高壓的作用而被破壞。

2.1.4 固液比對單寧得率影響 在提取壓力300MPa，保壓時間3min，溶液濃度60%的條件下，以不同的固液比裝入塑料瓶，固液比依次1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，測得不同條件下的單寧得率如圖5所示。

圖5 固液比對單寧得率的影響Fig.5 Effect of the solid-to-solution ratio on extraction rate

可以看出，單寧得率是隨固液比的變化而變化，當用更多的溶劑去混合物料時，得率逐漸上升。當固液比達到1∶25之后，單寧得率基本無變化。所以從經濟角度考慮，選擇1∶25的固液比足以滿足提取條件。

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗設計 設計結果見表2。

表2 響應面實驗設計方案Table 2 Design of response surface method

2.2.2 響應面實驗結果分析 響應面分析結果顯示如表3。

表3 響應面分析實驗結果Table 3 Test results of response surface analysis

表3分析結果中，該模型的F值是49.90，表明模型具有顯著性。p值小于0.05表明該因素為顯著因素，小于0.001表明該因素極其顯著。所以因素溶液濃度極其顯著，保壓時間及B2具有顯著性，但是四個因素之間的交互作用不顯著。分析可得二次方程為：

單寧得率=90.97-2.27A-4.75B+1.69C+3.05D+2.65AB+1.44AC+1.71AD+1.03B C+1.77BD-0.44CD-2.08A2-3.72B2-1.92C2+1.48D2

2.2.3 各因素之間交互作用 圖6～圖8反映了固液比與溶液濃度、溶液濃度與保壓時間、壓力值與保壓時間之間的交互作用。

圖6 固液比、溶液濃度響應面圖Fig.6 Response surface for effects of the solid-to-solution ratio and solution concentration on extraction rate of PLT

圖7 溶液濃度、保壓時間響應面圖Fig.7 Response surface for effects of solution concentration and holding pressure time on extraction rate of PLT

圖8 壓力值、保壓時間響應面圖Fig.8 Response surface for effects of pressure value and holding pressure time on extraction rate of PLT

2.3 驗證性實驗

根據響應面模型得出最優化的條件如下：壓力值為222.33MPa（取220MPa），保壓時間3min，溶液濃度為56.31%（取56%），固液比為1∶25，經三次平行實驗測得單寧得率為95.73%，與理論值96.19%接近。

2.4 超高壓提取與溶劑提取對比

溶劑提取柿葉單寧結果與超高壓提取結果對比，見表4。

從表4可以看出，超高壓提取柿葉單寧，不僅耗時短，提取效果也明顯高于溶劑提取。

表4 與溶劑提取方法比較Table 4 Compared with the solvent extraction method

3 結論

超高壓提取柿葉單寧，耗時短并且得率高，是一種不錯的選擇。最佳的提取條件為：乙醇濃度56.31%，固液比1∶25（g∶mL），保壓時間3min，壓力值222.33MPa，理論得率可達到96.19%。

超高壓作為新興提取技術尚未得到廣泛應用，超高壓設備的技術革新也有待進一步發展，相信超高壓加工技術的進一步提升，一定能給有效成分提取工業帶來極大的幫助，也能為市場提供更多更好的新產品。

[1]林嬌芬，林河通，謝聯輝，等.柿葉的化學成分、藥理作用、臨床應用及開發利用[J].食品與發酵工業，2005，31（7）：90-96.

[2]顧海峰，李春美，石寶琴，等.柿子單寧優化提取工藝探討[J].食品科技，2007，1（2）：133-136.

[3]李娜，林書玉，張小飛，等.超聲提取苦菜單寧實驗研究[J].陜西師范大學學報：自然科學版，2011，39（5）：43-45.

[4]張縱圓，張玲，彭秧.紫花苜蓿中單寧的提取工藝優化及體外抗氧化作用研究[J].食品工業科技，2011，32（1）：198-200.

[5]李鵬，張海生，牛國霞.柿葉單寧提取技術研究[J].食品工業科技，2009，30（9）：220-222.

[6]董海麗，王謙.枇杷葉總黃酮超高壓提取及抗氧化活性[J].中國農業通報，2011，27（5）：489-492.

[7]涂宗財，王艷敏，劉成梅，等.動態超高壓微射流技術在玉米花粉多糖提取中的應用[J].食品工業科技，2010，31（6）：212-217.

[8]樊振江，于旺堂，縱偉，等.超高壓提取柿葉黃酮的研究[J].食品工程，2008，2（6）：46-48.

[9]李雪雁，王羽翔，吳子謙，等.黑葉荔枝果殼中單寧提取研究[J].食品科技，2011，36（10）：187-190.

[10]馮愛青，胡秋孌，崔娟.銀杏葉中單寧提取工藝的優化研究[J].安徽農業科學，2009，37（15）：7177-7178.

[11]霍權恭，范璐，周展明.GBT15686-2008高粱單寧含量的測定[S].北京：中國標準出版社，2009.

[12]李波，王向陽，沈蓮清，等.響應面分析工藝參數對綠豆湯中活性成分的影響[J].食品工業科技，2011，32（1）：201-204.

[13]徐向宏，何明珠.試驗設計與Design-Expert、SPSS應用[M].北京：科學出版社，2010：146-157.

[14]Anese M，Nicoli M C，Dall G，et al.Effect of high pressure treatments on peroxidase and polyphenoloxidase activities[J].Food Biochemistry，1995，18：285-293.

Optimization of ultra high pressure extraction of persimmon leaf tannin by response surface method

LI Liang1，2，GU Shu-qin1，2，LU Da-xin1，*，YANG Dong1，2
（1.Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing 102206，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）13-0273-04

2011－12－05 *通訊聯系人

李亮（1984-），男，在讀碩士，研究方向：農產品加工及貯藏工程。