胰島素樣生長因子受體基因單核苷酸多態性與晚期非小細胞肺癌鉑類化療療效及預后的研究

陳愉生 邵慧 李鴻茹 韓麗麗 張祥娥

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，80%確診的NSCLC患者屬于晚期，需進行以內科治療為主的綜合治療。目前鉑類藥物聯合吉西他濱、紫杉烷類或長春堿類藥物治療是主要標準方案，但總有效率僅為30%-40%[1]，個體遺傳素質的不同可以導致化療效果的差異。有研究[2]表明基因多態性是決定治療反應性差異的重要因素。胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）和胰島素樣生長因子2受體（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF-2R）作為胰島素樣生長因子信號途徑的重要組成部分對調節細胞增殖、分化、凋亡有重要作用。IGF-1R與配體結合后激活酪氨酸激酶，促進細胞存活及抗細胞凋亡，但IGF-2R沒有酪氨酸激酶活性，不能傳導任何信號，是近年來備受關注的潛在腫瘤抑制因子。IGF-1R和IGF-2R基因中存在高度多態性，且某些堿基的突變與腫瘤的易感性有關，IGF-1R基因1013密碼子鳥嘌呤（G）→腺嘌呤（A）突變與2型糖尿病患者的食管癌發生密切相關[3]，IGF-2R+1619（G/A）野生純合型GG和IGF-2基因+3580位點AA純合突變的組合對肝癌發生有保護作用[4]。在腫瘤化療方面的研究[5]發現，體外抑制IGF-1R表達后順鉑作用肺癌細胞所引起的凋亡比例明顯增加，然而其基因多態性與肺癌化療療效的研究未見報道。本研究旨在通過PCR-RFLP方法檢測132例經鉑類化療的晚期肺癌患者IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）的基因型分布情況，探討其基因多態性與化療敏感性及生存期的關系，以期為臨床化療方案的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2009年10月-2011年10月期間住院的132例晚期NSCLC患者，納入標準：①所有患者均經病理確診并有可評估的病灶且無其它部位腫瘤；②均初次采用4周期的含鉑類化療方案，化療前血常規、肝腎功能正常，心電圖無明顯異常，Karnofsky評分60分以上，預計生存期＞3個月；③所有病人均簽署知情同意書且依從性好，能夠進行隨訪。“吸煙”指從開始吸第1支煙到目前為止，1年內吸煙量≥100支或每周至少2支，連續1年以上。腫瘤按照UICC肺癌TNM分期第7版分期，組織類型根據2004年WHO公布的“肺及胸膜腫瘤組織學分類修訂方案”將大細胞肺癌和未分化及未定性肺癌統稱為其他型肺癌。

1.2 化療方案及評價標準 根據肺癌的細胞類型和患者的全身情況制定化療方案，132例患者接受以順鉑（cisplatin, DDP）或卡鉑（carboplatin, CBP）為主的方案化療，其中14例采用DDP/CBP聯合伊立替康（CPT-11）治療（IP方案），46例采用用DDP/CBP聯合吉西他濱（gemcitabine, GEM）治療（GP方案），28例采用采用DDP/CBP聯合去甲長春堿（vinorelbine, NVB）治療（NP方案），31例采用采用DDP/CBP 聯合紫杉醇（paclitaxel, TAX）或多西紫杉醇（docetaxel, DOC）治療（TP方案），13例采用DDP聯合培美曲塞二鈉（pemet rexed disodium, PEM）治療。上述各方案每3周為1個周期，療程為4周期。根據2009年美國國立癌癥研究所實體瘤客觀療效評定標準修訂版RECIST 1.1進行療效評價[6]，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、穩定（stable disease, SD） 和進展（progressive disease, PD），設定CR+PR+SD且持續時間≥24周為臨床受益。對化療有效和病灶穩定的患者所采取的治療策略應為停止化療，進入觀察隨訪期，出現新的病灶后再進行二線治療或復治。生存時間指確診III期、IV期肺癌開始至死亡或末次隨訪時間，隨訪截止時間為2011年9月23日。所有患者均采用電話隨訪。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取 抽取每個研究對象外周肘靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，離心并分離白細胞，用DNA提取試劑盒提取白細胞基因組DNA，核酸分光分度計對DNA的濃度和純度進行檢測，所有標本OD260/OD280值在1.8-2.0之間符合PCR要求，DNA置-20oC低溫冰箱保存備用。

1.3.2 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCRRFLP）分析 根據文獻設計引物，IGF-1R+1013（G /A）（rs2229765）的上游引物：5'-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3'；下游引物：5'-CCTGTGCTGC ATTTTGGCGGCTTTTC-3'。 IGF-2R+1619（G/A）（rs629849）的上游引物：5'-AACAATGGTTAAAGCCGGATTG-3'，下游引物：5'-GGCCCGGGTGCAGCCAGGCACTG -3'。 PCR擴增體系（25 μL）含0.4 μmol/L上下游引物，0.02 mmol/L dNTP，1.25 U TaKaRaTaq酶，1×PCR buffer，100 ng DNA模板，加蒸餾水至25 μL。IGF-1R PCR反應條件：94oC預變性10 min，94oC變性20 s，54oC退火20 s，72oC延伸30 s；共36個循環，末次循環后，72oC再延伸10 min，產物為207 bp。IGF-2R PCR反應條件：94oC預變性5 min，94oC變性30 s，67oC退火60 s，72oC延伸30 s；共30個循環，末次循環后，72oC再延伸15 min，產物為456 bp，以蒸餾水替代模板DNA作為陰性對照。取10 μL PCR反應產物、1 U限制性內切酶，10×buffer tango 2 μL，18 μL無菌去離子水，37oC水浴過夜。取5 μL酶切產物經3 g/L瓊脂糖凝膠電泳，100 V、20 min，凝膠成像系統分型，IGF-1R PCR產物經酶切后出現103 bp、84 bp片段為GG純合基因型，出現84 bp、123 bp片段為AA純合基因型，出現103 bp、84 bp、123 bp片段為GA雜合基因型；IGF-2R基因PCR產物經酶切后出現307 bp和149 bp片段判定為GG純合基因型，出現完整456 bp片段判定為AA純合基因型，出現456 bp、307 bp和149 bp片段,則判定為GA雜合基因型，結果見圖1和圖2。

1.3.3 DNA測序 取50 μL PCR產物連同其上游引物由英濰捷基貿易有限公司采用雙脫氧法在ABI_3730XL 測序儀上進行單向測序，測序結果與PCR-RFLP方法一致。

1.4 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件，建立非條件Logistic回歸模型評價IGF-1R和IGF-2R基因多態性與鉑類化療療效的關聯，以比值比（odd ratio, OR）及其95%可信區間（confidence in terval, CI）表示基因型與療效的相關性。采用Kaplan-Merier法進行單因素生存分析，Log-rank檢驗比較不同基因型的生存期差異，Cox比例風險模型評估可能的因素對化療療效的影響。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 IGF-1R+1013（G/A）PCR產物經限制性內切酶MnlI消化后的電泳圖。M： marker；1：GG型；2，4：GA型；3：AA型；5：陰性對照。Fig 1 The agarose gel electrophoresis of IGF-1R+1013(G/A) by restrict endonucleases MnlI. M: maker; Lane1: GG genotype; Lane2, 4: GA genotype; Lane3: AA genotype; Lane5: negative control.

圖2 IGF-2R+1619（G/A）PCR產物經限制性內切酶MnlI消化后的電泳圖。M：marker；1，4：GA型；2：AA型；3：GG型；5：陰性對照。Fig 2 The agarose gel electrophoresis of IGF-2R+1619(G/A) by restrict endonucleases NciI. M: maker; Lane1, 4: GA genotype; Lane2: AA genotype; Lane3: GG genotype; Lane5: negative control.

2.1 IGF-1R+1013（G/A）、IGF-2R+1619（G/A）基因多態性與鉑類化療療效的關系 132例晚期肺癌患者中無CR，PR 38例，SD 62例，PD 32例，臨床受益率75.6 %（100/132）。以性別、年齡、吸煙狀況、組織類型、TNM分期、化療方案、IGF-1R和IGF-2R的基因多態性為自變量，以化療療效為應變量做非條件Logistic回歸分析，男性患者的臨床受益率低于女性患者（P=0.023）；IGF-1R和IGF-2R各等位基因符合Hardy-Weinberg平衡定律，IGF-1R+1013（G/A）GG、GA、AA基因型攜帶者和變異等位基因A攜帶者（GA+AA）的臨床受益率分別為75.5%、75.4%、78.6%和75.9%，差異無統計學意義（P＞0.05）；IGF-2R+1619（G/A）GG、GA、AA基因型攜帶者和變異等位基因A攜帶者（GA+AA）的臨床受益率分別為75.3%、76.6%、75.0%和76.5%，差異無統計學意義（P＞0.05）。聯合分析發現IGF-1R+1013（G/A）基因型與IGF-2R+1619（G/A）基因型對化療療效無協同作用（P=0.975）。見表1。

2.2 IGF-1R+1013（G/A）、IGF-2R+1619（G/A）基因多態性與生存期的關系 至隨訪截止時132例晚期肺癌患者中55例死亡，無失訪者，治療后中位生存時間（middle survival time, MST）為18個月。IGF-1R+1013等位基因A攜帶者（GA+AA）的MST短于GG基因型攜帶者（P=0.017），IGF-2R+1619等位基因A攜帶者（GA+AA）與GG基因型攜帶者相比，MST差異無統計學意義（P=0.575）（表2）。聯合IGF-1R和IGF-2R基因型分析顯示，兩基因聯合多態性與NSCLC的生存期有關，與同時攜帶這兩個基因的GG基因型的個體相比，攜帶IGF-1R+1013（G/A）突變等位基因A（GA+AA）同時攜帶IGF-2R+1619（G/A）GG基因型的患者MST短（P=0.031）；同時攜帶IGF-1R+1013（G/A）突變等位基因A（GA+AA）和IGF-2R+1619（G/A）突變等位基因A（GA+AA）的患者的MST也短（P=0.041）（表3，圖3）。

表1 晚期肺癌患者臨床特征、IGF-1R和IGF-2R的基因型與鉑類化療療效的關系Tab 1 The relationship among clinical features, IGF-1R and IGF-2R genotypes and efficacy of platinum- based chemotherapy

2.3Cox回歸模型多因素分析 年齡、性別、吸煙情況、組織類型、臨床分期、化療方案、IGF-1R和IGF-2R基因多態性8項變量均進入Cox模型進行分析，IGF-1R+1013（G/A）變異等位基因A是影響NSCLC預后的獨立危險因素，IGF-1R+1013（G/A）變異等位基因A攜帶者（GA+AA）的OR是GG基因型攜帶者的2.104倍（P=0.020），IGF-1R+1013（G/A）聯合IGF-2R+1619（G/A）基因多態性也是影響NSCLC預后的獨立因素（P=0.025）。見表4。

表2 IGF-1R+1013（G/A）、IGF-2R+1619（G/A）基因型與肺癌生存期的關系Tab 2 The relationship among polymorphisms of IGF-1R+1013(G/A) 、IGF-2R+1619(G/A) and median survival time (MST)

表3 IGF-1R+1013（G/A）、IGF-2R+1619（G/A）聯合基因型與肺癌生存期的關系Tab 3 The relationship among combined polymorphisms of IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A) and MST

圖3 IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）聯合基因型的生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier plot of overall survival in relation to the combined genotypes of IGF-1R+1013(G/A) and IGF-2R+1619(G/A)

表4 晚期NSCLC預后影響因素的Cox多因素回歸分析結果Tab 4 Cox multivariate regression analysis of prognostic factors in advanced NSCLC patients

3 討論

IGF-1R基因定位于15q25-26，全長約100 kb，有21個外顯子，IGF-2R蛋白是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白受體，由2個a-亞基（130 kDa-135 kDa）和2個β亞基（90 kDa-95 kDa）通過二硫鍵結合而形成四聚體（α2β2），與細胞外配體結合后，通過Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT兩條信號傳導通路起到促進細胞存活及抗細胞凋亡的作用[7]。IGF-2R基因定位于6q26，約136 kb，含有48個外顯子，其編碼的蛋白質是一個無內在催化活性的跨膜糖蛋白，與IGF-2配體結合后不能傳導信號反而加速IGF-2的降解。目前認為IGF-2R對IGF信號轉導通路所起的作用很可能是負向調節性的[8]。兩基因共同維持著細胞生長和凋亡的平衡，而在腫瘤細胞中出現IGF-1R的高表達和/或IGF-2R的低表達促進腫瘤的發生發展并與化療耐藥有關，Lee等[5]發現siRNA抑制IGF-1R表達后，順鉑作用A549肺癌細胞所引起的凋亡比例增加；Sangha等[9]發現在未經治療的NSCLC的治療中，以鉑類化療為基礎聯合IGF-1R單克隆抗體的治療方案有較好的效果，尤其是IGF-1R高表達的肺鱗癌患者；某些學者[10]還提出同時阻斷IGFR及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）途徑較單純阻斷EGFR途徑可明顯延長腫瘤患者生存期。藥理遺傳學研究[11]表明基因的單核苷酸多態性（single neucleotide polymorphism, SNP）可能導致基因組編碼的相應蛋白結構和功能發生改變，從而導致不同個體對疾病的易感性以及對藥物的敏感性產生差異。IGFR基因存在高度多態性且某些堿基的突變可導致編碼蛋白結構和功能的改變，為進一步探討IGFR基因與化療療效的關系，本研究選擇了與腫瘤相關的IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）多態性位點，研究其SNP與化療療效及預后的關系。

132例晚期NSCLC患者鉑類化療后的總體有效率（完全緩解+部分緩解）為36.4%，與文獻[12]報道39.2%接近，未發現IGF-1R和IGF-2R基因多態性與鉑類化療的臨床受益率有關（P＞0.05）。在此基礎上以更具有臨床意義的生存情況作為指標進一步分析其與晚期肺癌預后的關系，分析發現IGF-1R+1013（G/A）基因多態性單獨或聯合IGF-2R+1619（G/A）基因多態性與晚期NSCLC生存期有關。Bonafe等[13]研究發現IGF-1R+1013位點G→A堿基突變影響血清IGF-1的水平和人類壽命，攜帶IGF-1R+1013（G/A）突變等位基因A的個體血清IGF-1的水平低、壽命長，由于研究的人群不同，我們發現攜帶IGF-1R+1013（G/A）突變等位基因A的肺癌患者生存期短，雖然沒有檢測患者血清中IGF-1的水平，但推測IGF-1R的基因突變主要通過影響肺癌組織中IGF-1的水平而影響患者的預后，其分子基礎是IGF-1R +1013位點編碼的谷氨酸，鳥嘌呤（G）→腺嘌呤（A）突變雖然沒有導致編碼蛋白質的氨基酸改變，但可能通過影響mRNA的轉錄和穩定性改變增加IGF-1R蛋白的量，促進癌細胞生長分化，加快肺癌的進展，遠期療效表現為生存期縮短。對于IGF-2R+1619（G/A）的基因多態性與肺癌的關系國內外未見報道，本研究首次探討其基因多態性與晚期肺癌患者化療療效的關系，未發現兩者之間有相關性，其分子基礎可能是IGF-2R基因+1619位點G→A堿基突變雖然導致其編碼的氨基酸改變，但合成的IGF-2R蛋白改變對化療療效的影響不明顯。

盡管非條件Logistic回歸分析未能顯示IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多態性與鉑類化療療效有關，仍不能排除研究樣本量較小、人群種族及個體對藥物的特異性不同，同時入組人群給藥劑量、給藥時間的不同也會對結果造成影響，課題組擬擴大樣本繼續追蹤觀察。此外研究發現IGF-1R+1013（G/A）基因多態性單獨或聯合IGF-2R+1619（G/A）基因多態性與晚期NSCLC生存期有關，然而由于研究樣本量不夠大，影響化療預后的因素較多，目前研究所獲得的結果只是一種趨勢。因此IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）的基因多態性與鉑類化療療效的關系還有待大宗臨床研究證實。

致謝：感謝福州市肺科醫院在標本收集方面給予的大力支持！