潰瘍性結(jié)腸炎患者病灶組織血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶－1、－2表達(dá)與病程的相關(guān)性

劉寶海 樸雪花(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科，遼寧 錦州 200)

潰瘍性結(jié)腸炎主要因結(jié)腸黏膜表皮潰瘍，導(dǎo)致腸道無法發(fā)揮正常消化吸收功能，進(jìn)而造成排便困難和便血等癥狀，臨床主要以腹瀉、排便出血等癥狀為主〔1〕。老年人患潰瘍性結(jié)腸炎后，身體虛弱，抵抗能力急劇下降，各方面體征較年輕人嚴(yán)重〔2〕。本文主要探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1(ERK-1)和ERK-2與不同程度的潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 128例潰瘍性結(jié)腸炎患者為2011年1月至2012年1月來中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院接受診斷和治療，按照診斷結(jié)果可分為四組。30例初發(fā)型潰瘍性結(jié)腸炎患者為初發(fā)型組，男16例，女14例，年齡51～66〔平均(56.7±2.4)〕歲;31例慢性復(fù)發(fā)型潰瘍性結(jié)腸炎患者為慢性復(fù)發(fā)性組，男17例，女14例，年齡51～66〔平均(57.1±3.3)〕歲;32例慢性持續(xù)型潰瘍性結(jié)腸炎患者為慢性持續(xù)型組，男17例，女15例，年齡51～66〔平均(57.9±4.2)〕歲;34例急性暴發(fā)型潰瘍性結(jié)腸炎患者為急性暴發(fā)性組，男17例，女17例，年齡51～66〔平均(56.2±2.6)〕歲。四組患者性別比、平均年齡無顯著性差異，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)通過造影檢測診斷為潰瘍性結(jié)腸炎，可在結(jié)腸處觀察到明顯潰瘍病灶;(2)年齡≥50歲;(3)具有反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛、黏液便、膿液便等典型的臨床表現(xiàn)，至少有結(jié)腸鏡“X”線特征性改變中的一項(xiàng);(4)細(xì)菌性痢疾、阿米巴性結(jié)腸炎等病因明確的結(jié)腸炎排除在外;(5)非潰瘍性結(jié)腸炎腹瀉、腹痛、便秘等常見的臨床癥狀排除在外;(6)結(jié)腸潰瘍外的胃潰瘍等消化道疾病排除在外。

1.2.2 內(nèi)鏡檢查 集中對患者直腸和乙狀結(jié)腸處進(jìn)行內(nèi)鏡掃描，觀察黏膜表面是否有潰瘍、潰瘍類型以及面積等。各種類型潰瘍性結(jié)腸炎檢查標(biāo)準(zhǔn):(1)初發(fā)型:內(nèi)鏡檢查診斷為潰瘍性結(jié)腸炎，且為首次未有過往史;(2)慢性復(fù)發(fā)型:內(nèi)鏡檢查診斷為潰瘍性結(jié)腸炎，既往結(jié)腸炎患病史，又復(fù)發(fā)，且病變范圍較之前小;(3)慢性持續(xù)型:內(nèi)鏡檢查為潰瘍性結(jié)腸炎，且屬首次，病程有半年以上，伴持續(xù)性腹瀉、腹痛等癥狀;(4)急性暴發(fā)性:內(nèi)鏡檢查為潰瘍性結(jié)腸炎，發(fā)病快，癥狀嚴(yán)重且伴有高熱、急性結(jié)腸擴(kuò)張等癥狀。

1.2.3 病灶組織VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平檢測所有患者在進(jìn)行內(nèi)鏡檢查時(shí)，鏡頭均觸及潰瘍病灶處，取出鏡頭后收集鏡頭上的組織殘留物，使用TAKARA的mRNA抽提試劑盒進(jìn)行總mRNA抽提。使用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增出cDNA，然后使用各自引物擴(kuò)增VEGF、ERK-1、2片段，同時(shí)擴(kuò)增出內(nèi)參分子β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA。使用2%瓊脂糖電泳擴(kuò)增片段，并且使用Bio-rad凝膠成像儀和Image Lab軟件進(jìn)行拍照和光密度分析。

1.2.4 病灶組織 VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化檢測 取出患者病灶組織后，用4%多聚甲醛固定8 h后，用20%蔗糖脫水3 d(4℃)，用冷凍切片機(jī)切成冠狀切片，收集于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，然后分裝進(jìn)96孔板中，每個(gè)患者組織做三個(gè)復(fù)孔。按照參考文獻(xiàn)〔3〕進(jìn)行操作，一抗為大鼠抗VEGF、ERK-1、2多抗，采用濃縮型鏈霉素和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，二抗為試劑盒自帶的兔抗大鼠Fc段抗體，采用試劑盒顯色方法進(jìn)行顯色，并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以表示，所有計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病灶組織細(xì)胞內(nèi)VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平以β-actin光密度為內(nèi)參，四組患者病灶組織VEGF和ERK-1、2 mRNA相對光密度值逐漸增加，說明老年潰瘍性結(jié)腸炎逐漸增加，病灶組織細(xì)胞內(nèi)VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加。見圖1。

2.2 病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化結(jié)果 VEGF陽性率、ERK-1、2陽性率均隨著潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)展而不斷增加。四組患者VEGF和ERK-1、2平均陽性率逐漸增多，在急性暴發(fā)性患者中VEGF陽性率高達(dá)39.59%，ERK-1陽性率高達(dá)31.47%，ERK-2陽性率高達(dá)24.12%，比較各組間陽性率有顯著性差異(均P＜0.05)。見圖2，圖3。

圖1 病灶組織內(nèi)VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平

圖2 病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化結(jié)果

圖3 四組患者病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2陽性率比較

3 討論

認(rèn)為病灶組織VEGF、ERK-1和ERK-2是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其表達(dá)水平隨著病情的進(jìn)展而增加，具有預(yù)測潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的潛在價(jià)值。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，主要是由于腸道發(fā)生炎癥損傷導(dǎo)致〔4〕，目前發(fā)病機(jī)制仍不確切，主要為基因因素、機(jī)體免疫力和環(huán)境因素三種原因單獨(dú)或者多方面原因綜合導(dǎo)致〔5〕。其中機(jī)體免疫抵抗力是老年人易發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎的主要病因。有研究發(fā)現(xiàn)老年患者腸道黏膜免疫系統(tǒng)抵抗細(xì)菌的侵襲能力較年輕人弱，同時(shí)M細(xì)胞的數(shù)量也大大降低，該因素與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生率具有正相關(guān)性〔6〕。

潰瘍性結(jié)腸炎的診斷包括內(nèi)鏡、鋇灌腸和相關(guān)因子檢查，內(nèi)鏡和灌腸檢查可直接觀察出病灶處潰爛狀態(tài)，并且能夠區(qū)分出不同類型潰瘍性結(jié)腸炎，在臨床上被證明陽性檢出率高達(dá)90%以上〔7〕。但隨著人們對生活質(zhì)量的不斷追求，內(nèi)鏡檢查和鋇灌腸檢查逐步被取代，從而限制了該方法在老年患者身上大量應(yīng)用。內(nèi)鏡檢查易發(fā)人體嘔吐，痙攣等〔8〕，鋇灌腸檢查殘余的鋇鹽會(huì)對機(jī)體特別是對老年人帶來危害〔9〕。

相關(guān)因子例如細(xì)胞因子、各類代謝因子等均被證明與老年潰瘍性結(jié)腸炎具有相關(guān)性。有研究表明，病灶位置處細(xì)胞膜上趨化因子受體表達(dá)量較正常組織顯著提高〔10〕，說明患病后大量的趨化因子會(huì)富集在病灶位置發(fā)揮著炎癥作用。VEGF和ERK-1/2均被證明與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)，其中VEGF被認(rèn)為是腫瘤新生血管非特異性標(biāo)記物，新生血管需要VEGF和受體的作用而發(fā)揮血管再生功能，但這VEGF的過表達(dá)在結(jié)腸炎潰瘍組織處也被發(fā)現(xiàn)，表明該因子與炎癥相關(guān)〔11〕，本文發(fā)現(xiàn)在病灶位置處確實(shí)存在VEGF隨著病情加重逐漸增多的現(xiàn)象，mRNA轉(zhuǎn)錄的增加說明VEGF非其他組織通過血液轉(zhuǎn)移過來，而是組織本身細(xì)胞表達(dá)增加的緣故。ERK-1/2是有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶信號通路中關(guān)鍵的信號蛋白，通過磷酸化發(fā)揮著信號通路開啟和關(guān)閉功能，從而引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的開啟和關(guān)閉，控制著細(xì)胞因子等的表達(dá)。有研究表明ERK-1/2在潰瘍性結(jié)腸炎中確實(shí)存在磷酸化，起到連接轉(zhuǎn)移生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的作用。本文的研究結(jié)果與VEGF類似，證明了ERK-1/2非旁分泌作用轉(zhuǎn)移到病灶位置，而是通過自分泌方式在病灶位置大量表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。

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