電針對腦缺血再灌注模型大鼠紋狀體NMDA受體NR2亞基蛋白表達的影響

沈梅紅 劉曉華 項曉人 沈 潔 張 瑩 舒兆瑞 李忠仁

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京 210046)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體屬于興奮性氨基酸-谷氨酸離子型受體的一種，由NR1和NR2兩種亞單位組成，NR2是其調節亞單位，對整個受體通道的功能起修飾作用。NMDA受體不僅參與體內神經發育、學習記憶、興奮性突觸等多種生理過程，也參與傳遞神經元死亡、缺血性腦損傷、血管性癡呆等許多重要的病理過程〔1，2〕。但目前關于針灸對腦組織NMDA受體亞單位的研究主要集中在海馬和皮質區上〔3，4〕，而紋狀體是大腦中動脈缺血再灌注時的主要受損腦區之一。為此，本文通過觀察電針對缺血再灌注后大鼠紋狀體NMDA受體調節亞單位NR2A和NR2B蛋白表達的變化，探討電針對缺血再灌注興奮性氨基酸毒性的拮抗作用，進一步闡明電針治療缺血性腦血管疾病的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及腦缺血再灌注動物模型制作 8月齡清潔級SD健康雄性大鼠15只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔許可證號:SCXK(滬)2007-0005〕。所有大鼠自由攝食和飲水，生活在晝夜節律為12 h/12 h且保持室溫25℃的空間內，適應性喂養至體質量(300±20)g后進行實驗。實驗過程中對動物的處置符合國家科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。用數字隨機表將動物隨機分成制作模型大鼠10只、假手術組大鼠5只。模型動物根據前期研究〔5〕，采用改良Longa線栓大腦中動脈法制作局灶性腦缺血再灌注模型。假手術組大鼠的手術過程，除不插入線栓外，其余步驟與模型組一致。模型制作成功后，隨機分成模型組、電針組，各5只。具體如下:①模型組:制作大腦中動脈短暫性缺血再灌注模型，不做治療。②假手術組:只做手術血管分離，不做血管結扎，不插入線栓及治療。③電針組:造模同模型組，再灌同時電針“百會”、“大椎”兩穴30 min。

1.2 藥品與試劑 水合氯醛(AR，批號:30037517)購于國藥集團化學試劑有限公司，蒸餾水配制成10%的溶液;多聚甲醛(AR，批號:20071217)購自成都科龍化學試劑廠，用0.01 mol/L PBS配成4%多聚甲醛溶液;多聚賴氨酸、0.01 mol/L PBS、檸檬酸鹽抗原修復液、二抗〔即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒〕、3%過氧化氫溶液及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司;兔抗NR2A、NR2B單克隆抗體購于美國Abcam公司。

1.3 實驗儀器 Leica TP 1020型生物組織脫水機(德國);Leica RM 2145型石蠟切片機(德國);OLYMPUS-BX60生物組織顯微鏡(日本);OLYMPUS DP 71圖像獲取系統(日本);JD 801形態學圖像分析系統軟件(江蘇省捷達科技發展有限公司);DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);WQ 1002K電針儀(安隆光電技術公司);華佗牌不銹鋼一次性毫針(φ0.35 mm×25 mm，蘇州醫療用品有限公司)。

1.4 電針方法 電針組大鼠在成功制備腦缺血再灌注模型后進行電針治療“百會”、“大椎”兩穴，選穴標準依據《實驗針灸學》所附大鼠穴位圖譜。“百會”穴平刺，“大椎”穴斜刺(約30°角)，深度均為10 mm。捻轉刺激30 s后，接電針儀，“百會”接負極，“大椎”接正極。刺激參數:連續波，頻率3Hz，刺激強度以保持針刺局部輕微抖動為度(電流強度1～3 mA，電壓1～3 V)。時間:30 min。

1.5 取材 各組大鼠再灌注24 h，經10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射深度麻醉后，開胸先后用0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛固定液各200 ml經左心室及升主動脈灌流，開顱取腦，置4%多聚甲醛溶液中固定過夜備用。將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，取頭側第二片腦組織，浸泡在75%乙醇過夜。常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.6 HE染色及NR2A、NR2B蛋白表達 將已包埋好的石蠟塊作冠狀面切片(片厚5 μm)，從出現紋狀體完整結構開始取3張切片，分別用于HE染色及 NR2A、NR2B免疫組化檢測。NR2A、NR2B蛋白表達檢測方法，同參考文獻〔3〕進行操作。

2 結果

2.1 大鼠腦組織紋狀體區形態學觀察 由圖1可觀察到:假手術組大鼠腦組織紋狀體區有大量神經細胞分布，顆粒細胞呈橢圓形，細胞質不豐富，核質比大，核淡染清晰;可見少量錐體細胞，有長的突起，核漿比小，細胞核為圓形或橢圓形，著色為淺藍色，核仁深染，未見炎性細胞浸潤及細胞空泡變性和細胞壞死等。而模型組大鼠紋狀體區神經細胞分布較少，其中許多細胞胞體縮小、胞核固縮、深染，可見神經細胞壞死和凋亡，血管周圍、神經細胞和纖維束水腫。電針組大鼠紋狀體神經細胞內核固縮現象減輕，大小接近假手術組，神經細胞分布情況接近于假手術組。

圖1 各組大鼠紋狀體形態學觀察(HE，×400)

2.2 大鼠局灶性腦缺血后紋狀體區NR2A、NR2B表達

2.2.1 NR2A陽性細胞表達及圖像分析結果 由圖2可知，假手術組NR2A蛋白在大鼠紋狀體神經細胞有中等強度的陽性表達，陽性細胞多呈棕褐色，胞漿濃染，細胞排列分散在紋狀體陰性神經細胞中;與假手術組相比，模型組細胞排列稀疏，陽性細胞少見，胞質淡染;與模型組相比，電針組的陽性細胞數增多，胞質染色變深，細胞排列分散在紋狀體陰性細胞中。從表1可知:與假手術組相比，模型組大鼠受損側紋狀體中表達NR2A蛋白的陽性細胞數、平均光密度值明顯降低，平均灰度值明顯升高。與模型組比較，電針組紋狀體中NR2A陽性細胞數及細胞平均光密度值明顯增加，平均灰度值明顯降低，但仍與假手術組存在差異。

圖2 各組大鼠紋狀體NR2A表達情況(DAB，×400)

表1 各組大鼠紋狀體中NR2A陽性細胞數、平均灰度、平均光密度()

表1 各組大鼠紋狀體中NR2A陽性細胞數、平均灰度、平均光密度()

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，下表同

陽性細胞數 平均灰度 平均光密度假手術組組別 n 5 96.25±7.04 113.10±11.08 0.36±0.04模型組 5 58.60±2.301) 147.35±6.341) 0.24±0.021)電針組 5 72.20±12.721)2)132.03±6.701)2) 0.29±0.021)2)

2.2.2 NR2B陽性細胞表達及圖像分析結果 由圖3可知，假手術組中NR2B蛋白在細胞體中有少量陽性表達，可見其散在分布于紋狀體神經元中，胞質染色較淡;與假手術組相比，模型組紋狀體神經元中有高度表達，細胞排列紊亂，可見大量的陽性細胞，多呈棕褐色，胞質深染;與模型組相比，電針組的陽性神經元數目減少，染色變淡，細胞排列較稀疏。從表2可知大鼠紋狀體中NR2B表達結果:與假手術組相比，模型組紋狀體組織表達NR2B的陽性細胞數量、陽性細胞的平均光密度值明顯升高，平均灰度值明顯降低;與模型組比較，電針組紋狀體NR2B陽性細胞數、平均光密度值明顯降低，平均灰度值明顯升高。

圖3 各組大鼠紋狀體NR2B表達情況(DAB，×400)

表2 各組大鼠紋狀體中NR2B陽性細胞數、平均灰度、平均光密度()

表2 各組大鼠紋狀體中NR2B陽性細胞數、平均灰度、平均光密度()

陽性細胞數 平均灰度 平均光密度假手術組組別 n 5 61.00±4.55 142.08±8.89 0.25±0.02模型組 5 117.60±6.881) 109.68±9.111) 0.37±0.041)電針組 5 65.60±15.142) 126.00±6.301)2) 0.31±0.021)2)

3 討論

雖然腦缺血再灌注損傷后進行神經行為學評分，操作簡便，可直接觀察干預措施的效果，易于廣泛應用，但與腦損傷并不完全同步;而形態學觀察可作為評價腦缺血損傷情況的金指標。本研究說明造模可以促進神經元的損傷，而電針治療可以減少受損神經元數，減輕缺血后引起的腦損傷。

各種原因引起的腦缺血缺氧，其受損局部組織的神經元可釋放大量的興奮性氨基酸(EAA)，主要是谷氨酸(Glu)。再加上EAA重攝取減少以及死亡細胞大量溢出EAA，神經元壞死后小膠質細胞也可產生大量的Glu〔6〕，致使細胞間隙的EAA濃度很快增加。而細胞間隙中超常量的EAA持續強烈地作用于細胞膜上的Glu受體亞型-NMDA受體，導致Na+、Ca2+經受體門控通道大量內流，引起Ca2+超載，進而觸發一系列Ca2+依賴性反應，造成神經元進一步損傷。因此認為在缺血性腦損傷中NMDA受體發揮著關鍵作用，而該受體通道的調控被認為是目前治療缺血性腦卒中的重要靶點〔7〕。從理論上講，若能抑制NMDA受體的活性，就能減少鈣內流，有效地阻止NMDA受體介導的缺血性腦損傷的發生。

NMDA受體是由不同亞單位組成的異聚體，目前已發現生物體內有3種NMDA受體亞基，分別是NR1、NR2和NR3。其中NR3主要在發育中的中樞神經系統中表達，不形成Glu激活通道。NR1是NMDA受體的功能亞基，在大鼠中樞神經系統內廣泛分布，NR2是調節亞基，獨立存在時并不表達，它總是伴隨NR1存在于特定的腦區，增強NR1對興奮性氨基酸的反應〔8〕，而NR2亞基包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D等亞單位。在成年大腦中，NR2A在大部分中樞神經系統區域都有表達，而NR2B主要局限于前腦，NR2D在中樞神經系統中的表達慢慢減少，主要在丘腦和腦干，NR2C則在小腦。NR2A和NR2B均能調節NMDA受體的活性，但兩者在缺血性腦損傷中所發揮的作用是完全相反的〔9〕:NR2A促進神經保護作用的發揮，其激活有利于神經元的再生;而NR2B可介導自由基級聯反應，產生興奮性毒性作用，促進神經細胞凋亡的發生，且NR2B數目愈多，神經元對興奮性氨基酸的毒性作用愈敏感。為此，本研究設計并對照觀察腦缺血再灌注大鼠在再灌注24 h時紋狀體中NMDA受體亞單位NR2A和NR2B的蛋白表達以及電針干預后兩者的變化。

本文表明腦缺血再灌注可引起大鼠受損側紋狀體組織中NMDA受體亞單位蛋白表達的改變，這與徐鐵軍等〔10〕研究前腦缺血再灌流后大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2A和NR2B蛋白質表達結果基本相符。而與模型組大鼠相比，給予電針“大椎”、“百會”穴治療后的大鼠紋狀體組織NR2A表達細胞數及含量均明顯升高，表達NR2B的細胞數及含量均明顯下降。結合前期研究推測，電針一方面可能通過激活局部神經元表達大量NR2A受體蛋白，促進受損紋狀體區域神經元再生;另一方面通過阻抑NR2B受體蛋白的過量表達，來抑制自由基的大量生成，降低局部神經元對興奮性氨基酸毒性作用的敏感性，從而調節NMDA受體復合物的整體功能活性，減少NMDA受體介導的興奮性氨基酸毒性反應，減輕腦缺血再灌注引起的局灶性腦損傷，發揮一定的腦神經保護作用。為了更深入探討電針對腦缺血再灌注大鼠的NMDA受體的影響，可采用實時熒光RT-PCR等分子生物學技術進一步研究。

1 王玉梅，劉永平，曹 凱，等.黃芩莖葉黃酮對慢性腦缺血大鼠腦內NMDA受體和VEGF表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2012;28(2):353-7.

2 韋登明，賈學敏，尹向旭，等.電針改善血管性癡呆大鼠學習記憶及其與海馬神經細胞谷氨酸、NMDAR表達的關系〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(19):3738-40.

3 劉曉華，沈梅紅，項曉人，等.電針對腦缺血再灌注模型大鼠海馬NMDA受體2A、2B亞型表達的影響〔J〕.遼寧中醫雜志，2011;38(10):2080-2.

4 陳澤斌，鄒 峰，袁 芳，等.針刺預處理對腦缺血再灌注大鼠頂皮質NR2A和NR2B蛋白表達的影響〔J〕.中國中西醫結合急救雜志，2005;12(2):79-83.

5 沈梅紅，李忠仁，項曉人，等.電針對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層超微結構的影響〔J〕.針刺研究，2009;34(3):167-70.

6 Pais TF，Figueiredo C，Peixoto R，et al.Necrotic neurons enhance microglial neurotoxicity through induction of glutami-nase by a MyD88-dependent pathway〔J〕.Neuroinflammation，2008;5(1):43.

7 Pei DS，Wang XT，Liu Y，et al.Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR6-9c peptide containing the TAT protein transduction sequence〔J〕.Brain，2006;129(2):465-79.

8 Prybylowski K，Wenthold RJ.N-Methyl-D-aspartate receptors:sub unit assembly and trafficking to the synapse〔J〕.J Biol Chem，2004;279(11):9673-6.

9 Liu Y，Wong TP，Michelle Aarts.NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo〔J〕.J Neurosci，2007;27(11):2846-57.

10 徐鐵軍，樊紅彬，張鳳真，等.前腦缺血再灌流后大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2A和NR2B蛋白質表達的變化〔J〕.神經解剖學雜志，2004;18(2):110-6.