腸淋巴液引流對創傷失血性休克大鼠多器官自由基與一氧化氮的影響

常海峰 牛春雨 趙自剛 韓 瑞 張玉平 杜舒婷 杜會博

(河北北方學院微循環研究所，河北 張家口 075029)

研究表明，休克腸淋巴液是加重組織器官損傷的重要因素〔1～3〕，結扎腸淋巴管，可減少失血性休克以及二次打擊大鼠重要器官肺、腎、心肌、肝組織炎癥因子的產生，降低自由基損傷，改善組織器官功能〔4～8〕，其機制與減少腸淋巴液攜帶的多種毒性物質回流至全身有關〔9〕;Deitch課題組也報道失血性休克復蘇后，腸系膜淋巴液可活化在體和離體的中性粒細胞，使之通透性增高，促進急性肺損傷，如事先行腸系膜淋巴管結扎，則可防止肺損傷〔10，11〕;雖然腸淋巴管結扎阻斷了休克淋巴液回流至全身，但在臨床上的應用值得考慮。為此，課題組采用淋巴液引流術，發現休克淋巴液引流可提高創傷失血性休克(T/HS)大鼠平均動脈血壓(MAP)，減輕多個器官組織損傷的程度，改善器官功能，其機制與改善能量代謝有關〔12〕。本文進一步從自由基與一氧化氮角度，探討休克淋巴液引流減輕T/HS大鼠多器官損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 18只健康清潔級Wistar雄性大鼠，體重250～330 g(購自中國醫學科學院動物繁殖中心)，以隨機數字表法隨機均分為:對照組(僅麻醉及手術);淋巴液引流組與淋巴液回流組，后兩組復制T/HS模型，淋巴液引流組行腸淋巴液引流。

1.2 創傷失血性休克模型復制 大鼠全身麻醉(肌肉注射質量分數1%戊巴比妥鈉，劑量50 mg/kg)后，行股部無菌手術，分離右側股動脈，插三通管連接生物信號采集系統(成都儀器廠)，記錄 MAP;分離股靜脈，注射質量分數 0.5%肝素(1 ml/kg，700 U/ml)全身抗凝。腹部手術，分離腸淋巴管，行腸淋巴管插管、引流休克腸淋巴液至實驗結束作為淋巴液引流組;不插管、保證淋巴液回流作為淋巴液回流組。待MAP穩定10 min后，淋巴液引流組及回流組大鼠以ZCZ-50型自動抽注機(浙江醫科大學醫學儀器廠)自股動脈勻速放血至40 mmHg，5 min完成，保留備回輸;以調整放血量維持低血壓90 min后，淋巴液引流組及回流組均以WZF-250F2型雙道微量注射泵(浙江大學醫學儀器有限公司)自股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(量為全血量)，時間控制在20 min左右。對照組僅麻醉、股部、腹部手術，不放血及輸液。

1.3 標本留取及指標檢測 大鼠于輸液復蘇后3 h(或相應時間點)，選擇固定位置留取腎、肝、肺、心肌組織，應用FJ-200型高速分散均質機(上海標本模型廠)制備10%組織勻漿，應用高速低溫離心機(德國科峻)以2 500 r/min離心10 min，取上清液備檢。應用改良硫代巴比妥酸微量法、硝酸還原酶法分別檢測各器官組織勻漿丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)(南京建成)含量，組織勻漿蛋白采用考馬斯亮藍法定量。

2 結果

2.1 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響 淋巴液回流組的肺、腎、心肌、肝以及淋巴液引流組心肌組織勻漿的MDA含量均顯著高于假手術組(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流組肺、腎、心肌、肝組織勻漿的MDA含量均顯著低于淋巴液回流組(P＜0.01)。見表1。

表1 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響(nmol/mg，，n=6)

表1 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響(nmol/mg，，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與淋巴液回流組比較:3)P＜0.01，下表同

1.40±0.21 1.71±0.31 1.78±0.12 1.42±0.15淋巴液回流組2.62±0.602)2.95±0.612)3.60±0.612)3.34±0.822)淋巴液引流組1.38±0.243)1.82±0.503)1.81±0.753)2.09±0.651)3)組別 肺 腎 肝 心肌對照組

2.2 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響 淋巴液回流組的肺、腎、心肌、肝以及淋巴液引流組腎組織勻漿的NO含量均顯著高于假手術組(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流組肺、腎、心肌、肝組織勻漿的NO含量均顯著低于淋巴液回流組(P＜0.01)。見表2。

表2 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響(nmol/mg，，n=6)

表2 休克淋巴液引流對T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響(nmol/mg，，n=6)

1.60±0.20 2.05±0.19 1.68±0.30 1.98±0.38淋巴液回流組2.51±0.572)3.28±0.442)4.02±0.702)2.66±0.391)淋巴液引流組1.44±0.563)2.46±0.341)3)2.11±0.393)1.57±0.463)組別 肺 腎 肝 心肌對照組

3 討論

恢復組織灌流是氧自由基大量產生與釋放的過程，缺血-再灌注引起的氧自由基損傷在休克發病過程中起重要作用〔13〕。內皮細胞是缺血-再灌注過程中氧自由基的最早來源，氧自由基激活補體，補體系統被激活后，補體活化產物(C3a、C3b、C5a等)可以刺激巨噬細胞和中性粒細胞釋放細胞因子和氧自由基，后者進一步攻擊內皮細胞而加重損傷。本研究結果表明，由于失血，T/HS大鼠在休克再灌注后即有大量自由基生成，自由基產物MDA在肺、腎、肝、心肌等組織的含量顯著增多，結果提示自由基損傷是T/HS大鼠多器官損傷的重要機制。淋巴液引流組將休克腸淋巴液引流至體外，減少了休克腸淋巴液中毒性物質的腸源性移位，抑制了自由基的產生與釋放，降低了各組織器官的MDA含量，從而減輕自由基對各器官組織細胞的損傷作用。

NO作為一種具有多重生理功能的介質，參與調節血管和氣管的平滑肌舒張、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制血小板和紅細胞聚集黏附、神經細胞間的信息傳遞、調節細胞黏附分子的表達、機體免疫防御、細胞溶解等多方面發揮重要的作用。近年來的研究表明，NO在休克的病理生理過程中發揮了重要作用，在內毒素、缺氧等刺激因素以及細胞因子的作用下，由中性粒細胞、內皮細胞、巨噬細胞等在iNOS催化作用下合成，與血管反應性下降、器官功能衰竭及病死率等密切相關〔14〕，而NO引起炎癥反應的瀑布效應，是引起導致多器官損傷的重要原因;降低NO水平可減輕MODS大鼠與失血性休克的器官損傷〔4～7，15〕。本研究結果顯示，手術創傷、失血、液體復蘇后，T/HS大鼠肝、腎、心肌、肺等重要器官的NO含量明顯升高，提示NO參與T/HS的器官功能障礙與損傷;休克淋巴液引流后，上述器官的NO含量下降，說明休克淋巴液引流減少了NO的合成與釋放;同時，由于NO可通過刺激中性粒細胞產生呼吸爆發及脫顆粒，釋放氧自由基和蛋白水解酶，加重組織器官的自由基損傷，形成自由基與炎癥的級聯反應，因此休克淋巴液引流降低組織自由基損傷也有可能是通過減少NO實現的。

從本文研究結果來看，休克腸淋巴液引流降低自由基損傷與NO水平的作用與腸淋巴管結扎具有相似的作用;且前期表明，引流休克腸淋巴液引起機體血容量的小量丟失并未對機體產生不良影響，本文為淋巴液引流術的進一步臨床應用奠定了實驗基礎。

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