20(S)－人參皂苷Rg3對結腸癌干細胞增殖及凋亡的影響

韓 博 蔣依紋 張 晨 周 悅 王 毅 (吉林大學藥學院，吉林 長春 130021)

腫瘤干細胞是實體腫瘤組織內具有自我更新能力的細胞亞群，能夠分化為多種細胞系而引起腫瘤的形成〔1〕。研究證明，結腸癌的復發是由具有顯著增殖能力但數量稀少的腫瘤干細胞引起的。研究表明，人參皂苷Rg3對乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌及宮頸腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用〔2～4〕。但現有研究主要集中于人參皂苷Rg3的R型，對于其同型異構體S型〔Rg3(S)〕的研究，特別是其對腫瘤干細胞作用的研究甚少。本實驗擬選用人結腸癌細胞株HCT-116作為研究對象，觀察Rg3(S)對結腸癌干細胞增殖及凋亡的影響，為Rg3(S)的抗結腸癌作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養細胞 人結腸癌細胞株HCT-116購于中科院上海細胞庫，在含10%胎牛血清的McCoy'S 5A培養液中，置于5%CO2、37℃培養箱中培養。

1.1.2 主要試劑 標準胎牛血清、McCoy'S 5A、DMEM/F12培養基、0.25%胰蛋白酶、B27(50×)(Gibco公司);免疫磁珠試劑盒、表面細胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Sigma公司);Biotin-上皮特異性黏附分子(EpCAM)單抗及Biotin-CD44單抗(eBioscience);膽囊收縮素8肽(CCK-8)(日本同仁);乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基亞砜(DMSO)(上海生工);半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9及Caspase-3分光光度檢測試劑盒(南京凱基生物);Rg3(S)(吉林大學)。

1.2 方法

1.2.1 EpCAMhighCD44+HCT-116結腸癌干細胞的篩選 以EpCAM及CD44作為結腸癌干細胞篩選標記，利用Biotin標記抗體和免疫磁珠法篩選EpCAMhighCD44+結腸癌干細胞，篩選得到的EpCAMhighCD44+HCT-116細胞培養于含100 U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素、2 μg/ml EGF、2 μg/ml bFGF、B27 的DMEM/F12無血清培養基中，37℃，5%CO2條件下培養，待結腸癌干細胞的微球生長至100個細胞時，傳代，每3～5 d換液1次。

1.2.2 誘導分化實驗 收集對數生長期EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，于37℃、5%CO2條件下培養;觀察 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的形態變化。

1.2.3 細胞生長曲線的測定 取對數生長期的結腸癌HCT-116細胞及EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，接種于96孔板，每孔 500 個細胞，分別于 6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96 h后，利用CCK-8試劑盒檢測OD450 nm，繪制生長曲線。

1.2.4 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的時效/量效關系確定 取對數生長期的EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，培養24 h后加藥。每組設3個復孔，分別加入終濃度為 80、160、320、640、1 280、2 560、5 120 μg/ml人參皂苷Rg3(S)(實驗組);不加藥物的細胞為對照組。分別于孵育 3、6、9、12、24、48、72 h 后以 CCK-8 測定OD450 nm。細胞抑制率=實驗組OD值/(對照組OD值－實驗組OD)×100%。

1.2.5 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，培養24 h后，分別加入終濃度為 160、320、640 μg/ml的 Rg3(S);30 μg/ml絲裂霉素(陽性對照);不加藥物的細胞為陰性對照。藥物作用48 h后，以CCK-8法測其OD450 nm，檢測Rg3(S)對其增殖的抑制作用;細胞抑制率按公式計算，細胞抑制率=實驗組OD值/(對照組OD值－實驗組OD)×100%。

1.2.6 Caspase-9及Caspase-3的檢測 取對數生長期的Ep-CAMhighCD44+HCT-116細胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板，培養48 h 后，分別加入終濃度為 160、320、640 μg/ml的 Rg3(S);30 μg/ml絲裂霉素(陽性對照);不加藥物的細胞為陰性對照組。藥物作用48 h后，收集細胞，按試劑盒說明提取蛋白，分光光度計測定OD405 nm。Caspase酶活性以OD誘導劑/OD陰性對照比值表示。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，數據資料以表示，組間均數的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的形態 經過無血清培養5～6 d后，可觀察到小的微球形成，每個球形體由10～20個細胞聚集而成。隨培養時間延長，可見球形體直徑增大，大小不一，折光性較強，懸浮于培養基中;將EpCAMhighCD44+HCT-116細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基后，原來懸浮生長的細胞逐漸貼壁生長。見圖1，圖2。

圖1 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的無血清培養(×200)

圖2 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的誘導分化(×200)

2.2 細胞增殖 EpCAMhighCD44+細胞的體外增殖速度略高于腫瘤細胞HCT-116，進入平臺期后二者增殖速度達到一致。見圖3。

2.3 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的影響不同濃度的Rg3(S)對結腸癌干細胞EpCAMhighCD44+HCT-116的增殖均具有一定的抑制作用，其中Rg3(S)濃度為640 μg/ml、作用時間為48 h時，對細胞增殖的抑制率最高;48 h之后抑制作用達到平臺期。見圖4。

2.4 Rg3(S)對 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞 Caspase-9及Caspase-3酶活性的影響 隨 Rg3(S)濃度增高，EpCAMhighCD44+HCT-116細胞中的Caspase-9和Caspase-3的酶活性也增強，并且經 640 μg/ml Rg3(S)作用后，EpCAMhighCD44+HCT-116細胞中的Caspase-3活性顯著高于陽性藥物絲裂霉素組(P＜0.05)。提示Rg3(S)具有較強的促進EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡的作用。見表1。

圖3 生長曲線

圖4 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的影響

表1Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡酶活性的影響()

表1Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡酶活性的影響()

與絲裂霉素組比較:1)P＜0.05

8.05±0.39 320 3.66±0.20 5.92±0.83 160 1.32±0.15 1.53±0.12絲裂霉素Caspase-3 Caspase-9 Rg3(S) 640 7.11±0.781)組別 劑量(μg/ml)30 1.78±0.16 6.92±0.58

3 討論

人參皂苷可以抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，對化療有促進療效的作用〔5〕;動物實驗也顯示人參皂苷可以抑制小鼠體內肝癌的生長和癌細胞增殖〔6〕。

本研究以細胞表面抗體EpCAM及CD44作為標記，免疫磁珠法篩選結腸癌細胞HCT-116無血清條件下培養，3～7 d后可見明顯結腸癌干細胞微球，并且第2代結腸癌干細胞仍具有成球能力;在含血清的培養條件下進行誘導分化實驗，結腸癌干細胞在第3天呈貼壁狀態，提示其開始分化為結腸癌細胞;Rg3(S)作用24 h后細胞增殖明顯受到抑制，48 h時達最大抑制率，當Rg3(S)濃度為640 μg/ml時，抑制率最高。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用;Caspase-9是級聯酶的上游分子，可被線粒體向細胞質釋放的細胞色素C激活。激活的Caspase-9可引起下游級聯酶的活性，如Caspase-3〔7〕。Caspase-9在正常狀態下以酶原的形式存在于胞質中，沒有活性;但在細胞發生凋亡階段時則被激活。

Caspase-3是細胞凋亡蛋白級聯反應的必經之路，活化的Caspase-3可活化其他Caspases和多種胞質內和核內成分，因此通過檢測Caspase-3活性可了解細胞凋亡情況。本實驗觀察到Rg3(S)作用后，Caspase-9及Caspase-3的活性顯著增強，提示細胞發生凋亡〔8〕。

綜上所述，Rg3(S)可激活Caspase-9、Caspase-3途徑，抑制人結腸癌干細胞的增殖，促進細胞凋亡。然而，目前對Rg3(S)致凋亡機制的研究尚未完善。本研究為今后進一步探索Rg3(S)對結腸癌干細胞的作用機制奠定了基礎。

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