蛇菰水提物對大鼠酒精性肝損傷的保護作用

周衛華 石慧娟 楊梅松竹 鐘 飛 米長忠 (吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000)

酒精濫用和由此導致的酒精依賴已成為現代社會嚴重的公共衛生問題〔1〕，蛇菰科為雙子葉多年生寄生肉質草本植物，具有補肝益腎，止血生肌，調經活血，清熱醒酒之功效〔2〕，廣西瑤族和黔南布依族民間有飯酒前服用蛇菰解酒的習俗。蛇菰的解酒毒作用已經得到證實〔3〕，臨床試用于肝炎和肝硬化有一定療效〔4〕。但蛇菰提取物對酒精性肝損傷的保護作用還未見報道，本實驗利用大鼠酒精性肝損傷模型，研究蛇菰提取物對酒精誘導的肝損傷模型大鼠的保肝作用及其可能機制，為其開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠40只，體重200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。蛇菰:購自吉首市益豐藥店，經吉首大學醫學院藥理學教研室鑒定。無水乙醇(國藥集團化學試劑公司);谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(20100827);谷草轉氨酶(AST)試劑盒(20100828);丙二醛(MDA)試劑盒(批號20110616);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20110616);谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(20110615);BCA蛋白濃度測定試劑盒(20110905)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 蛇菰水提物的制備 蛇菰全草50℃過夜干燥，粉碎過60目篩子，量取50 g用蒸餾水500 ml溶解，煎煮1 h，過濾得濃縮液，經旋轉蒸發得其浸膏12.76 g，將其配置成50 ml，相當于每毫升含生藥1 g，實驗時稀釋至所需濃度。

1.2.2 實驗分組與給藥 40只大鼠購回后適應性喂養5 d，將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、蛇菰水提物低劑量組和高劑量組各10只。造模〔5〕共需10 d，正常組:6.0 ml/kg生理鹽水灌胃，1 h后50%葡萄糖14 ml/kg灌胃;模型組:每天定時以6.0 ml/kg生理鹽水灌胃，1 h后二鍋頭14 ml/kg灌胃;蛇菰水提物組:蛇菰水提物低劑量組和高劑量組定時分別給予1.5 g/kg和3 g/kg蛇菰水提物灌胃，1 h后以二鍋頭14 ml/kg灌胃。

1.2.3 血清ALT和AST的活性測定 第11天，用20%的烏拉坦麻醉大鼠，摘眼球取血，3 500 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明書，測定血清AST和ALT活性。

1.2.4 肝組織蛋白質、MDA、SOD、GSH-Px含量及活性的測定用20%的烏拉坦麻醉大鼠，解剖取相同部位的肝組織冰浴研磨10 min，然后用玻璃勻漿器研磨10 min，用冷生理鹽水配制成10%肝勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書，測定肝組織蛋白質、MDA含量和SOD、GSH-Px活性。

1.2.5 肝組織病理學檢查 用20%的烏拉坦麻醉大鼠，解剖取其肝右中葉，10%的甲醛固定24 h，常規脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE染色，光學顯微鏡觀察結果并照相。

2 結果

2.1 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠血清ALT和AST的影響 模型組大鼠血清AST和ALT活性顯著高于正常組(P＜0.01)，而蛇菰水提物不同劑量組血清AST和ALT明顯低于模型組(P ＜0.01)，見表1。

表1 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠血清ALT和AST的影響(，n=10)

表1 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠血清ALT和AST的影響(，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別 AST(U/L) ALT(IU/L)正常組 65.54±12.041) 58.55±11.751)模型組 164.82±31.09 170.59±30.75蛇菰低劑量組 110.76±15.221) 115.32±16.781)蛇菰高劑量組 90.98±26.781) 85.02±27.581)

2.2 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD，GSH-Px活性和MDA含量的影響 與正常組相比，模型組的SOD和GSHPx活性顯著降低(P＜0.01)，MDA含量顯著升高(P＜0.01);蛇菰水提物各劑量組的SOD和GSH-Px活性升高，與模型組差異顯著(P＜0.01)，MDA的含量降低與模型組差異顯著(P＜0.01)，見表2。

表2 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD，GSH-Px活性和MDA含量的影響(，n=10)

表2 蛇菰水提物對酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD，GSH-Px活性和MDA含量的影響(，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別 SOD(U/mg) SH-Px(U/mg) MDA(nmol/mg)正常組 27.60±4.981) 44.76±7.391) 9.38±1.581)模型組 12.79±1.94 24.56±4.76 19.34±3.26蛇菰低劑量組 17.48±3.781) 32.08±4.952) 15.82±2.432)蛇菰高劑量組 21.38±3.581) 36.12±5.641) 14.83±2.722)

2.3 肝組織的病理學檢查 大體解剖肉眼觀察可見，正常組大鼠肝臟呈紅褐色，質地柔軟，富有彈性。酒精性肝損傷組大鼠肝臟體積增大，淤血明顯，肝臟表面有少量點狀出血。蛇菰水提物組肝臟輕度腫大，比較接近正常組。顯微鏡觀察如圖1所示，正常組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，大小均勻，無變性、壞死等病理改變，肝索排列整齊，無炎癥細胞浸潤;模型組大鼠肝小葉結構被破壞，肝索排列紊亂，肝細胞呈大面積水腫變性，胞漿疏松透亮，部分肝細胞脂肪變，匯管區有炎細胞浸潤;蛇菰水提物處理組較模型組肝細胞水腫和脂肪變程度明顯減輕，炎細胞浸潤程度也有所減輕。

圖1 蛇菰水提物酒精性肝損傷大鼠肝組織的影響(HE，×400)

3 討論

本研究證實大鼠酒精性肝損傷模型是成功的。經蛇菰水體物干預后，大鼠肝組織脂肪變性和炎癥浸潤明顯減輕，大鼠血清ALT、AST活性下降，表明蛇菰對酒精性肝損傷有顯著的保護作用。

乙醇經胃腸道吸收，約90%在肝細胞內氧化代謝。乙醇代謝產生大量有害自由基，包括O－2、H2O2、OH－及C2H5O－和C2H5OH－〔6〕;機體抗氧化能力不足以應付自由基的積累，氧化應激便發生在肝臟中，氧化應激在肝功能損害中發揮重要作用〔7〕。由此產生的自由基氧化生物膜脂質，破壞肝細胞膜及線粒體膜的正常結構，最終導致細胞結構和功能的改變〔8〕。MDA是脂質過氧化的產物，可作為反映機體組織或細胞受自由基攻擊和損傷的指標;GSH-Px和SOD是體內主要的抗氧化的酶，其活力的高低反映了機體清除自由基和抗氧化能力的高低。本研究中模型組大鼠MDA含量顯著升高，而SOD和GSH-Px活性顯著降低。而灌胃給予蛇菰可增強肝臟的SOD和GSH-Px活性，并降低其MDA含量，其護肝作用可能是通過增強肝細胞內清除自由基的酶的活性實現的。王慧等〔9，10〕研究表明，蛇菰提取物具有較強的抗氧化活性;而蛇菰中含有三萜類、苯丙素類、甾醇類、鞣質類、黃酮類及其苷類等多種化學成分，其中三萜類、苯丙素類及黃酮類均具有抗氧化活性，但具體是哪一種成分具有保肝作用，需要進一步研究。

1 Moriarty KJ，Platt H，Crompton S，et al.Collaborative care for alcohol-related liver disease〔J〕.Clin Med，2007;7(2):125-8.

2 王 慧，羅 兵，鄒 坤.蛇菰的化學成分及藥理活性研究進展〔J〕.時珍國醫國藥，2008;19(4):809-11.

3 張朝卿，戎聚全，沈振華，等.葛根、蛇菰解酒毒的實驗研究〔J〕.黔南民族醫專學報，2003;16(4):196-8.

4 陳吉炎，李 聰，王雪芹，等.蛇菰屬藥用植物的種類與研究進展〔J〕. 時珍國醫國藥，2010;21(8):2032-4.

5 張維麗，潘 玲，胡勝軍，等.枳黃方對急性酒精性肝病大鼠TNF-α和內毒素的影響〔J〕.中西醫結合肝病雜志，2006;16(2):99-100.

6 Conde de la Rosa L，Moshage H，Nieto N.Hepatocyte oxidant stress andalcoholic liver disease〔J〕.Rev Esp Enferm Dig，2008;100(3):156-63.

7 Niemela O，Parkkila S，Juvonen RO，et al.Cytochromes P450 2A6，2E1，and 3A and production of protein-aldehyde adducts in the liver of patients with alcoholic and non-alcoholic liver diseases〔J〕.J Hepatol，2000;33(6):893-901.

8 Bailey SM，Cunningham CC.Contribution of mitochondria to oxidative stress associated with alcoholic liver disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2002;32(1):11-6.

9 王 慧，張紅歧，鄔昊洋，等.筒鞘蛇菰提取物及松柏苷的抗氧化作用研究〔J〕.三峽大學學報(自然科學版)，2009;31(3):99-101.

10 鄧 靖，莫正昌，汲廣全，等.蛇菰提取物體外抗氧化活性研究〔J〕.食品科學，2010;31(5):23-5.