兒茶素對放射性損傷大鼠肺組織TNF－α表達水平的影響

石衛民 高 蕾 陳龍華 宋維舒 (南方醫科大學南方醫院放療科，廣東 廣州 5055)

兒茶素，分子式C15H14O6，存在于茶葉、蘋果、葡萄、紅酒和可可等膳食中，包括4種單體成分:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，具有抗衰老、抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞增殖以及誘導腫瘤細胞凋亡等作用〔1～4〕。有研究發現其單體及混合體對不同組織具有不同程度的輻射防護作用，其研究見于外周血淋巴細胞、小腸絨毛細胞等〔5～8〕，而目前尚未見對于放射性肺損傷的研究。本實驗擬研究兒茶素混合體對放射性肺損傷的影響和對照射后肺組織TNF－α表達的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性Wistar大鼠，購自廣州省實驗動物中心，體重(200±20)g。供試前在SPF級清潔動物房常規飼養3 d，觀察無異常者進入實驗。

1.2 茶兒茶素混合品 兒茶素混合體(主要EGCG 50%～60%，EGC 30%，余為ECG和EC)購自廣東省中藥研究所，純度95%以上。

1.3 照射條件 使用美國瓦里安公司的VARIAN 2300C直線加速器(廣州中醫藥大學廣東省中醫院放療科)產生的6 mV X線。照射時大鼠清醒狀態俯臥于體模固定板上，用瓦里安直線加速器6 mV X射線等距離照射全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，左、右至胸廊外側，大鼠全身其余部分用擋鉛屏蔽。源皮距為 100 cm，計算點深度為 2 cm，劑量率為320 cGy/min，一次性照射劑量為15 Gy。

1.4 方法 實驗大鼠隨機分為4組，每組10只。兒茶素+照射組動物每日予兒茶素，100 mg/kg腹腔注射，從照射前一天開始，直至照射后第6天，共7 d;單純兒茶素組100 mg/kg腹腔注射7 d。空白對照組及單純照射組每日腹腔注射生理鹽水20 ml/kg。實施照射后2 w、6 w，各組動物隨機取5只，處死后分別取肺組織在10%中性甲醛緩沖液中固定準備制作病理蠟塊。①HE染色光鏡觀察:由病理科醫生在顯微鏡下觀察肺組織病理學變化(盲法)。②肺組織TNF－α蛋白免疫組化染色檢測:一抗為abcan生物技術公司兔抗鼠多克隆抗體，抗體工作濃度為1∶2 000;二抗為福州邁新公司通用試劑盒，按試劑盒說明書操作。每張切片在400倍視野下選取10個有代表性、無重疊、不連續視野，盲法計數陽性細胞，取平均數。

1.5 統計學處理 各組動物TNF－α染色陽性的細胞數比較用t檢驗，用SPSS13.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 肉眼觀 大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可見單純照射組小鼠的肺組織表面明顯點片狀充血，出血病灶，而在照射+兒茶素組的肺組織僅呈充血狀，未見明顯出血病灶。

2.2 組織學結果 單純照射組動物肺損傷較重，包括肺泡內出血，肺泡、支氣管上皮、血管的改變，血管周圍水腫較明顯;特別是在單純照射組動物中發現由于肺泡出血引起肺實質灶性實變和肺泡上皮水腫;相比之下，照射+兒茶素組動物的肺泡間隔增厚、上皮細胞損傷、血管改變的程度都較單純照射組減輕。見圖1。

2.3 免疫組化結果 ①鏡下觀:空白對照組和單純兒茶素組，在其支氣管上皮中TNF－α呈不均一表達，在肺實質中少量肺泡巨噬細胞呈陽性表達，而血管內皮和肌層均呈陰性。單純照射組和照射+兒茶素組大鼠，2 w即可見肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡細胞呈陽性表達，肺實質中有大量陽性巨噬細胞聚集在血管外膜周圍，照射后6 w時整個肺實質布滿大量陽性巨噬細胞。②陽性細胞計數:空白對照組和單純兒茶素組陽性細胞數相對較低，為(18±4)及(20±8)個，照射后2 w時單純照射組的陽性細胞數為(96±21)個，較上述兩組明顯增高，有統計學意義(P＜0.01);照射+兒茶素組的細胞數為(38±14)個，顯著低于單純照射組(P＜0.01)。照射后6 w時單純照射組的陽性細胞數為(79±16)個，照射+兒茶素組的細胞數為(26±14)個，仍然顯著低于單純照射組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織組織學改變(HE，×100)

圖2 各組大鼠肺組織TNF-α表達(×200)

3 討論

電離輻射作用于生物機體時，最初的事件就是通過直接作用使組織產生DNA損傷或通過間接作用產生自由基(包括OH－，O－2等)，自由基作用于細胞成分(如膜、胞漿體和DNA等)，細胞成分損傷的信號啟動細胞信號傳導系統，導致一系列細胞因子的表達，并最終導致細胞死亡、增殖或細胞外基質蛋白產生等事件，產生臨床輻射損傷。研究證實，兒茶素清除機體過量自由基的作用對染色體具有保護作用。Nair等〔8〕以EC處理大鼠1 h后全身照射γ射線4 Gy，用堿性彗星分析法測定其外周血淋巴細胞的DNA鏈斷裂情況，發現EC減輕了外周血淋巴細胞的DNA損傷。Yamamoto〔5〕把正常人唾液腺上皮細胞和口腔鱗狀細胞癌細胞用EGCG處理后再用γ射線照射，用MTT法和5－溴脫氧尿核苷核素摻入法檢測，發現EGCG對于正常人唾液腺上皮細胞的輻射損傷具有防護效果。Matuo〔9〕用MTT法研究茶水提取物處理后巨噬細胞進行照射的效應，發現其對巨噬細胞有輻射保護作用。高能射線所致的生物效應有2/3是因間接作用而發揮作用，因此兒茶素的自由基清除作用使其有可能發展成為一個好的輻射防護劑，但是目前對于兒茶素輻射防護的體內研究較少。

本研究發現大鼠肺單劑量照射15 Gy后2 w出現肺組織嚴重充血、滲出和水腫，而經兒茶素處理后再進行照射的大鼠肺組織肺泡間隔和間質水腫有效減輕。Lee等〔7〕研究發現四種兒茶素單體都對實驗動物具有輻射防護作用，而四種單體混合物的放射防護作用強過任何一種單體。

放射性肺損傷，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放療、骨髓移植預處理的常見并發癥，是一個有多種細胞參與、多種細胞因子調控的復雜過程。當肺臟受到照射后，分泌介導放射性肺損傷發生的細胞因子，包括TNF－α、IL－1α、IL－1β、IL－4、MCP－1 以及 TGF－β、PDGF、IGF－1、bFGF 等，介導了后一系列損傷事件發生，產生病理組織學改變〔10〕。TNF－α是調節細胞因子網絡的啟動因子，介導損傷后起初的炎性反應，如改變血管內皮的通透性，增加血管滲出，刺激中性粒細胞等炎性細胞的趨化反應，加強單核巨噬細胞的吞噬功能;同時，TNF－α還具有促進成纖維細胞生長及刺激 IL－1、IL－6等其他細胞因子釋放的作用〔11，12〕。本研究發現，大鼠肺單劑量照射15 Gy后2 w肺組織中TNF－α即明顯升高，直到照射后6 w繼續升高，而兒茶素+照射組的大鼠肺組織中TNF－α較照射組減低，說明兒茶素可能通過下調TNF－α的表達減輕了放射性肺炎的程度。

本研究證實兒茶素對大鼠照射肺有一定保護作用，可能由于其自由基的清除作用，減少了受照射組織的DNA損傷，從而通過降低肺組織TNF－α的分泌而減少了放射性肺損傷，是否有其他細胞因子分泌的改變尚不清楚，各種兒茶素單體對大鼠肺組織的放射防護情況也有待進一步研究。

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