氯丙嗪協(xié)同欖香烯對PLA801D細胞的增殖抑制作用

王力玄 周佳瑩 馬忠森 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院2009級，吉林 長春 3002)張 俠 (南航吉林分公司航衛(wèi)室)

肺癌近年來發(fā)病率呈上升趨勢〔1〕，由于各種因素的影響，患者明確診斷時往往已達晚期，失去手術(shù)根治的機會，故化療成為這類患者治療的主要手段。但由于多藥耐藥(MDR)的存在常致使藥物對肺癌的治療失敗，嚴重影響化療的效果和預(yù)后。因此，本文應(yīng)用鹽酸氯丙嗪作為化療藥物欖香烯的增敏劑，觀察其對PLA801D細胞的增殖抑制作用及細胞周期進程的變化，旨在為肺癌化療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PLA801D細胞株購于北京解放軍總醫(yī)院;欖香烯乳注射液為大連金港制藥有限公司生產(chǎn)，國家二類抗腫瘤藥，RPMI1640培養(yǎng)基;MTT試劑購于美國Sigma公司，胎牛血清購自長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 收集對數(shù)生長期的PLA801D細胞，調(diào)細胞數(shù)為2×105/ml接種96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 ml，當(dāng)細胞生長達到80%匯合時分為單純欖香烯組20、40、80 μg/ml及空白對照組，每個濃度10復(fù)孔 靜止培養(yǎng)24 h后，于培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入MTT試劑，每孔內(nèi)20 μl，MTT終濃度為500 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，每孔內(nèi)分別加入二甲基亞砜溶液150 μl/孔。10 min后于酶標儀570 nm處測試各孔吸光度A值，根據(jù)下列公式計算PLA801D細胞增殖抑制率:PLA801D細胞抑制率=(1－加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%

1.2.2 聯(lián)合組用藥方法 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，取40 μg/ml欖香烯組再加入4 mg/ml氯丙嗪為聯(lián)合組。

1.2.3 流式細胞術(shù) 細胞分組同1.2.2，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 μl培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集不同濃度欖香烯作用的PLA801D細胞，離心棄上清，加入70%冷乙醇固定4℃內(nèi)保存，上機前過40目尼龍網(wǎng)，調(diào)細胞數(shù)為1×106/ml，PI染色流式細胞儀分析，結(jié)果以Modifi 2.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件，細胞周期分析采用F檢驗，細胞增殖抑制率分析采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PLA801D細胞增殖抑制率 MTT結(jié)果顯示單純欖香烯組20、40、80 μg/ml組隨著欖香烯濃度的增加細胞抑制率增高。三組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;但是聯(lián)合組(40 μg/ml欖香烯聯(lián)合4 mg/ml氯丙嗪)效果最佳，細胞抑制率超過單純80 μg/ml欖香烯組。見表1。

表1 不同濃度欖香烯對PLA801D細胞的增殖抑制率(，%)

表1 不同濃度欖香烯對PLA801D細胞的增殖抑制率(，%)

組別 A值 抑制率(%) P值1.39±0.11 － －20 μg/ml組 1.12±0.18 19.5 ﹤0.01 40 μg/ml組 0.93±0.15 33.1 ﹤0.01 80 μg/ml組 0.84±0.21 39.6 ﹤0.01聯(lián)合組 0.71±0.22 49.2 ﹤0.01對照組

2.2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 單純欖香烯組隨著藥物濃度增加細胞周期進程變化明顯，尤其是聯(lián)合組變化顯著，證明氯丙嗪可促進欖香烯的藥代動力學(xué)作用，具有較強的增敏效應(yīng)。見表2。

表2 不同組別對PLA801D細胞周期進程的影響(，%)

表2 不同組別對PLA801D細胞周期進程的影響(，%)

59.4±2.4 35.9±1.3 4.6±1.7 0.5 20 μg/ml組 52.3 ±3.1 43.9 ±1.7 9.6 ±0.8 6.2 40 μg/ml組 40.2 ±2.6 39.9 ±1.8 16.6 ±1.4 9.7 80 μg/ml組 35.3 ±2.1 46.6 ±1.6 18.1 ±2.3 13.0聯(lián)合組凋亡率對照組組別 G0/G1 S G2/M 26.3±2.1 52.7±2.7 20.9±3.2 17.5

3 討論

肺癌的耐藥性一直是影響其化療效果的一大難題。耐藥性的產(chǎn)生機制非常復(fù)雜，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷有新的觀點提出〔2〕，尤其是化療增敏劑的應(yīng)用，為肺癌多藥耐藥拮抗治療開辟了新途徑。化療增敏劑是指沒有抗腫瘤作用，但能提高已知有抗腫瘤作用藥物的化療效果〔3〕，增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷或降低其對正常組織毒性的一類藥物。氯丙嗪屬于吩噻嗪類化合物，是一種鈣調(diào)蛋白抑制劑，與化療藥物作用后顯著改變化療藥物的藥代動力學(xué)機制〔4〕，不僅能使藥物達到有效濃度，而且可減少藥物的毒副作用，葉欣等〔5〕報道鹽酸氯丙嗪具有體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，但其協(xié)同欖香烯抗腫瘤作用的報道甚少。

本研究應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度的欖香烯對PLA801D細胞增殖抑制均獲得較為滿意的結(jié)果，尤其是欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對PLA801D細胞的抑制率達高于欖香烯80 μg/ml組，說明氯丙嗪與欖香烯合用具有顯著的協(xié)同作用。

本研究還應(yīng)用流式細胞儀檢測不同濃度的欖香烯對PLA801D細胞周期進程的影響。結(jié)果顯示，G1/G0期細胞增多，S期細胞減少G2/M期細胞相對增多。G1/G0期細胞又稱細胞復(fù)制前期，G1期是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體。細胞周期中的G1→S期是細胞轉(zhuǎn)錄的交接點，已經(jīng)確認為是細胞生長調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控點，它能阻止細胞過度或無限制生長。因此抑制細胞周期G1期的RNA及核蛋白體的合成，間接地使腫瘤細胞減少，尤其是聯(lián)合組作用更為顯著，抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化進程，從而使G2期細胞相對增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔6〕。這一點從細胞凋亡率上可得到證實。

綜上所述，欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對PLA801D細胞增殖抑制有較強的協(xié)同作用，但其協(xié)同效應(yīng)機制目前還不十分清楚，有待進一步深入研究。

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4 Okumieff P，Meyn RE，Teicher B，et al.Report from the radiation oncology committee of the Southwest Oncology Group(SWOG):Research objectives workshop ，2003〔J〕.Am J Clin Oncol，2003;26(5):522-5.

5 葉 欣，沈紹華陳立軍，等氯丙嗪對耐藥細胞系 K562/A0Z多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究〔J〕.腫瘤防治雜志，2004;11(10):1304-5.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostagland in E2 stimulates the growth of coloncancer cells via induction of amphire gulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-20.