小牛血清去蛋白注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注后Caspase－12表達的影響

閔鶴鳴 黃 澈 魯璐清 姜興千 王文娟 武曉寧 羅玉敏 閔連秋

(遼寧醫學院基礎學院，遼寧 錦州 121001)

內質網應激(ERS)介導的細胞凋亡是一種不同于經典凋亡途徑的新的細胞凋亡途徑〔1〕，它所引發的細胞凋亡是通過下游的調控信號分子產生的，其中一個重要的途徑就是ERS介導的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspases-12)途徑〔2〕。研究表明Caspases-12與內質網的聯系非常顯著，且只有在ERS引發的細胞凋亡中起作用〔3〕。小牛血清去蛋白注射液(DCSI)的主要藥理活性成分為磷酸肌醇寡糖(IPOs)和小分子激活肽〔4〕，對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用〔5，6〕，但其具體機制還不十分清楚。本實驗擬探討DCSI是否通過阻斷ERS引發的細胞凋亡途徑對腦缺血再灌注損傷大鼠產生保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，共130只，體重(300±20)g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-0007。DCSI購自錦州奧鴻藥業有限責任公司(商品名:奧德金;批號:20080810);Caspase-12兔抗大鼠抗體由北京博奧森生物有限公司提供;RT-PCR試劑盒由大連寶生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 健康SD大鼠隨機分為假手術組(10只)、模型組(60只)和DCSI組(60只)，每籠6只。DCSI組按照每日80 mg/kg的劑量于術前1 w開始經大鼠尾靜脈注射給藥，1次/d，末次給藥時間在術前5 h;模型組和假手術組給予相同體積的生理鹽水，療程和給藥方法與DCSI組相同。分別在腦缺血再灌注后3、6、12、24、48 h五個時間點進行神經缺損功能評分，然后處死大鼠，進行后續實驗。

1.2.2 動物模型的建立 參照Longa等〔7〕方法加以改進制備大鼠大腦中動脈(MCA)局灶性腦缺血再灌注模型。模型成功的標準為大鼠清醒后出現左側Horner征及對側以前肢為主的癱瘓，神經行為學評分1～3分〔4〕。假手術組僅暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)，栓線插入CCA及ICA但不阻斷MCA。采用Longa等〔7〕6級5分制評分標準進行神經行為學評估。

1.2.3 腦組織病理學觀察 切片常規脫蠟水化，焦油紫染色。正常細胞不同程度的含有尼氏體，經焦油紫染色后呈藍色，細胞凋亡后，細胞質內尼氏體可發生變化，甚至可以消失。

1.2.4 TUNEL檢測大鼠海馬細胞凋亡情況 切片常規脫蠟水化，3%H2O2室溫處理后蛋白酶K 37℃消化10 min。標記液32℃標記2 h，后封閉30 min，生物素化地高辛抗體37℃反應37 min。加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色。常規封片，鏡下觀察，在海馬CA1區和假手術組相應區域不重復隨機選取5個高倍視野，計算陽性細胞百分比(陽性細胞數/計數細胞總數×100%)。

1.2.5 免疫組化檢測大鼠海馬Caspase-12抗原的表達 石蠟切片經常規脫蠟、復水，按照免疫組化試劑盒說明進行常規SABC法，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。顯微鏡下觀察大腦海馬CA1區Caspase-12表達情況，染色陽性反應物為棕黃色顆粒。每只大鼠取1張腦組織切片，顯微鏡下定位，取缺血側大腦海馬CA1區觀察，每張免疫組化切片中采集5個具有代表性的高倍視野，根據光鏡400倍時陽性細胞計數，采用雙盲法計算每個高倍鏡視野Caspase-12陽性細胞數。

1.2.6 Western印跡檢測大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達用10%的水合氯醛按350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉動物，斷頭取腦。參照Ishige等〔8〕方法進行勻漿，上樣，電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，洗膜后進行增強化學發光法(ECL)反應，暗室曝光，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統攝像分析測定目標帶(IDV)，計算出各組目標帶與β-actin的比值。

1.2.7 RT-PCR檢測大鼠海馬Caspase-12 mRNA的表達 取凍存的腦組織置于離心管中，Trizol法抽提RNA。參照Bian等〔9〕方法構建反應體系。Caspase-12和β-actin基因全長檢索自Pubmed GenBank，引物由南京金思特科技有限公司設計。Caspase-12上游引物:5'-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3'，下游引物5'-AGTTCACCTGGGACCTCA-3'，預擴增片段438 bp。

β-肌動蛋白(β-actin)上游引物:5'-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3'，下游引物:5'-AGCCAGGGCAGTAATCTC-3'，預擴增片段為630 bp。經30個循環后，取20 μl反應產物，加2 μl 10倍上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，成像，測目的基因和β-actin的表達強度，以同一標本的β-actin產物強度值校正各目的基因的強度值，相對值=目的基因表達強度/β-actin表達強度。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計分析軟件中的單因素方差分析，數據以的形式表示，組間差異比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 DCSI對腦缺血再灌注后大鼠神經行為的影響 模型組和DCSI組大鼠清醒后出現不同程度的左側Horner征及對側以前肢為主的癱瘓，5個時間點神經行為學評分在1～3分，造模成功。假手術組神經行為學評分為0。與模型組比較，DCSI組各時間點癥狀相似，神經行為學評分相對較低，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點神經行為學評分(分，)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點神經行為學評分(分，)

組別 模型組 DCSI組3 h 2.50±0.58 2.20±0.45 6 h 2.40±0.55 2.00±0.63 12 h 2.50±0.58 2.25±0.50 24 h 2.67±0.58 2.25±0.96 48 h 2.40±0.89 2.25±0.50

2.2 DCSI對腦缺血再灌注后大鼠腦組織病理變化的影響大鼠海馬CA1區腦組織病理學尼氏染色光學顯微鏡(×400)下觀察。假手術組尼氏體清晰可辨，受染后呈塊狀，尼氏體大而數量多，反映神經元合成蛋白質的功能較強;模型組尼氏體減少甚至消失，表現為尼氏體從核周開始崩解為細塵狀顆粒，并逐漸向外擴展，進而完全溶解消失，胞質著色淺，胞體腫脹，細胞由多極形變為圓形，胞核移位;DCSI組與假手術組比較各時間點有不同程度的尼氏體減少，但與模型組相比，神經元細胞中尼氏體明顯增加，神經元細胞的損害相對較輕。見圖1。

2.3 DCSI對腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區神經細胞凋亡的影響 假手術組海馬CA1區偶見細胞凋亡，推測是生理性死亡。腦缺血再灌注后模型組和DCSI組均可見神經細胞凋亡，除缺血再灌注3、6 h后凋亡細胞數無明顯差異外，缺血再灌注12、24、48 h時DCSI組的凋亡細胞數均少于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 三組大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的變化(%，)

表2 三組大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的變化(%，)

P1值:模型組與假手術組比較;P2值:DCSI組與模型組比較;下表同

組別 假手術組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 2.21±0.71 9.03±2.38 0.012 7.29±2.06 0.519 6 h － 19.85±2.01 0.000 17.95±3.75 0.435 12 h － 28.67±4.01 0.000 21.79±5.03 0.019 24 h － 54.50±3.71 0.000 44.42±4.75 0.002 48 h － 48.19±6.59 0.000 35.09±5.87 0.000

2.4 免疫組化檢測大鼠腦缺血再灌注后Caspase-12抗原的表達 Caspase-12抗原陽性細胞呈棕黃色，細胞皺縮、變形，胞質胞核均有表達，但以胞核表達為主，多數細胞發生壞死的形態學改變，可見核固縮、核溶解。與假手術組相比，模型組和DCSI組Caspase-12抗原表達均明顯增高(P＜0.01);與模型組相比，除3 h、48 h兩組差異不明顯外，DCSI組其余各時間點Caspase-12抗原表達均明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見表3。

表3 三組大鼠海馬Caspase-12抗原的表達()

表3 三組大鼠海馬Caspase-12抗原的表達()

組別 假手術組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 4.00±0.89 8.00±0.82 0.060 8.00±1.41 1.000 6 h － 27.40±4.28 0.000 22.33±3.14 0.013 12 h － 67.25±3.78 0.000 44.50±3.70 0.000 24 h － 86.33±3.51 0.000 72.50±5.69 0.000 48 h － 14.20±3.42 0.000 10.25±1.89 0.073

2.5 Western印跡方法檢測各組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達 Caspase-12蛋白在假手術組表達很少，缺血再灌注后各時間點表達逐漸增加，至24 h時達到高峰，然后逐漸下降，與假手術組相比，模型組和DCSI組表達均明顯增加(P＜0.01)。與模型組相比，DCSI組各個時間點Caspase-12蛋白表達相對較少(P＜0.01)。見表4，圖2。

2.6 RT-PCR檢測大鼠腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA的表達 Caspase-12 mRNA在假手術組表達很少，缺血再灌注后隨時間的延長表達逐漸增加，至24 h達到高峰后逐漸下降，與假手術組相比，模型組和DCSI組表達均明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，DCSI組在除3 h外的各時間點Caspase-12表達均顯著降低(P＜0.01)。見表5，圖3。

圖1 DCSI對大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區腦組織病理變化的影響(尼氏染色，×400)

表4 三組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(，×103)

表4 三組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(，×103)

組別 假手術組 模型組 P1值 DCSI組 P2值7 0.000 6 h － 172.30±2.18 0.000 162.73±0.84 0.000 12 h － 184.10±0.78 0.000 175.76±1.27 0.000 24 h － 212.70±1.42 0.000 205.76±0.43 0.000 3 h 144.21±1.67 160.14±1.74 0.000 151.17±0.9 48 h － 192.62±0.68 0.000 178.80±1.76 0.000

圖2 DCSI對大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區Caspase-12蛋白表達的影響(Western印跡法)

表5 DCSI對腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA表達的影響()

表5 DCSI對腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA表達的影響()

組別 假手術組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 0.63±0.01 0.71±0.02 0.000 0.69±0.03 0.260 6 h － 0.78±0.04 0.000 0.73±0.01 0.001 12 h － 0.87±0.02 0.000 0.81±0.01 0.000 24 h － 0.95±0.01 0.000 0.86±0.02 0.000 48 h － 0.83±0.01 0.000 0.78±0.02 0.007

圖3 DCSI對大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區Caspase-12 mRNA表達的影響(RT-PCR)

3 討論

缺血期間，特別是再灌注時，自由基的產生與內源性抗氧化系統失衡，會引起腦組織損傷。本研究參照Longa等〔7〕方法加以改進制備大鼠MCA局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后出現左側Horner征及對側以前肢為主的癱瘓，5個時間點神經行為學評分在1～3分，模型成功。細胞和分子學水平結果顯示，模型組大鼠缺血的海馬神經細胞胞體腫脹，細胞由多極形變為圓形，胞核移位，尼氏體減少甚至消失，Caspase-12蛋白表達/基因轉錄明顯上調，表現為細胞凋亡征象。

Caspases-12定位于內質網的外膜，是介導ERS凋亡的關鍵分子。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而其他死亡刺激仍可誘導其發生凋亡，表明Caspase-12與ERS介導凋亡的機制有關，而與非ERS介導的凋亡無關〔10〕。本研究發現，在腦缺血再灌注初期Caspase-12表達不明顯，隨著再灌注時間的延長逐漸升高，在24 h時達到高峰。分析可能在ERS初期，ERS誘導了未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR)，形成自我保護通路〔11〕，但是當ERS的時間過長時，ERS就會啟動凋亡途徑，激活Caspase-12，表現為缺血再灌注后期Caspase-12的表達上調。以上機制尚待進一步研究，但可推測對其適當干預可能成為腦缺血再灌注損傷的潛在治療靶點。本研究發現，與模型組相比較，無論在Caspase-12蛋白表達還是基因轉錄水平，DCSI組在各個時間點的海馬組織內檢測水平均較低，并且DCSI組大鼠的神經行為學改變相對較輕，反映細胞蛋白合成功能的尼氏體減少程度也較輕，細胞凋亡數明顯減少，推測DCSI可能通過抑制Caspase-12的表達和活化，從而抑制由Caspase-12介導的內質網應激引起的神經元的損傷和凋亡，發揮神經保護作用。

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