IGF－1修飾的神經干細胞對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響

楊華山 王金國 蔣莉莉 (鄭州大學護理學院，河南 鄭州 450052)

由于阿爾茨海默病(AD)患者腦內環境的改變，淀粉樣β蛋白(Aβ)的沉積阻礙了內源性神經干細胞的增殖及分化為成熟的神經元，使退變或損傷的神經元得不到足夠的修復〔1，2〕。胰島素樣生長因子(IGF-1)可調節神經細胞的生長、發育和分化。Mustafa等〔3〕發現家族性AD成員的IGF-1水平明顯低于其家族中的健康成員。Rivera等〔4〕報道，AD患者的大腦組織中IGF-1及其受體的表達明顯比對照組低，IGF-1受體陽性的細胞明顯減少，且和疾病的嚴重程度有明顯的相關性。在本室的前期研究中，構建了IGF-1基因的逆轉錄病毒載體，并轉染了神經干細胞(NSCs)，發現在被pLXSN-IGF-1病毒轉染過的NSCs中IGF-1基因有較高的表達〔5〕。本實驗將IGF-1基因修飾的NSCs植入AD模型大鼠的側腦室，觀察其對AD模型大鼠學習記憶的改善效果，并檢測IGF-1在動物體內的表達情況，旨在為NSCs移植和基因治療AD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠(3～4月齡，體重260～320 g)，由鄭州大學實驗動物中心提供。取成功AD模型大鼠24只，分為AD模型組、NSCs組、IGF-1修飾的神經干細胞移植組(IGF-1/NSCs組)，另設正常對照組，每組8只。

1.1.2 主要試劑和儀器 IGF-1抗體均購自武漢博士德公司。Y型電迷宮(張家港生物醫學儀器廠)、熒光顯微鏡(日本尼康E600)、大鼠立體定向儀 SN-2型(日本東京成茂科學器械研究所)。

1.2 方法

1.2.1 AD 模型制備 Aβ1～40溶于無菌生理鹽水(2 μg/μl)，用前37℃孵育1 w以上，使其變為聚集狀態。除正常對照組以外的三組大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)，參照Paxinos大鼠圖譜，選取雙側海馬CA1區為注射靶區，具體部位見參考文獻〔1〕。

1.2.2 腦內移植IGF-1基因修飾神經干細胞 造模8～10 d行腦細胞移植。移植前1 d，加入培養的NSC和IGF-1修飾的NSC 5 h，漂洗2遍后再用新鮮培養液培養16 h，收集并計數培養的NSC和IGF-1-NSC。利用大鼠立體腦定位儀進行腦室內移植，分別吸取 NSC和 IGF-1-NSC細胞懸液各5 μl(約3×105)，按選定的側腦室坐標進針(AP:0.6 mm、L:1.5 mm、V:4 mm)，注射速度為 0.5 μl/mm，留針 10 min。

AD模型組則以相同的方法、同樣的位點注入等量無菌生理鹽水。正常對照組不施以任何處理。移植4 w后進行行為學檢測和病理學觀察。

1.2.3 AD大鼠行為學檢測 采用Y型電迷宮:①學習能力測試:以大鼠受電擊后從起步區直接逃至安全區為正確反應，以連續10次中有9次(9/10)正確反應前所需的電擊次數(即嘗試次數)表示其學習獲得能力。②記憶再現測試:上述達標大鼠休息24 h后，同法檢測其記憶力。以達9/10標準前的嘗試次數表示記憶再現能力。

1.2.4 免疫組織化學染色 迷宮試驗結束后各組大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)后，經主動脈相繼灌注生理鹽水100 ml、40 g/L多聚甲醛(4℃)350 ml。快速取腦，固定后于移植點附近做層厚10 μm冰凍切片，IGF-1一抗:兔抗IGF-1抗體，二抗:羊抗兔IgG。DAB顯色5 min，蘇木素復染2 min，染色后進行脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照。

1.2.5 移植后AD大鼠腦內病理改變 迷宮試驗結束后各組大鼠經4%多聚甲醛灌注取腦，進行病理學觀察。

2 結果

2.1 AD模型建立 模型組海馬區椎體細胞明顯減少，同時可見許多細胞體積縮小，胞核固縮，染色加深。細胞形態與正常海馬神經元不同。顯示模型建立成功。

2.2 不同實驗組AD模型大鼠的行為學變化 與正常對照組比較，模型組大鼠空間學習能力、記憶能力均顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。兩個細胞移植組空間學習能力、記憶能力均顯著高于模型對照組(P＜0.05，P＜0.01)，基本達到正常水平(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空間學習和記憶能力的比較()

表1 各組大鼠空間學習和記憶能力的比較()

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

學習時間 正確記憶時間正常對照組 8 57.12±5.282) 8.50±0.672)組別 n AD模型組 8 98.62±7.69 3.80±0.55 NSCs組 8 72.47±6.371) 6.70±0.471)IGF-1/NSCs組 8 66.43±6.852) 7.50±0.592)

2.3 免疫組織化學染色 移植4 w后，IGF-1修飾的神經干細胞移植組大鼠在海馬可見較多的IGF-1陽性細胞，主要分布在海馬CA1、CA3區多形層和分子層及齒狀回，呈點狀沿多形層和分子層長軸分布，AD模型組大鼠海馬CA1區多形層和分子層染色較正常組淺。見圖1。

圖1 各組免疫組織化學染色結果(×100)

2.4 移植后各實驗組AD大鼠模型腦內病理改變 光鏡下觀察各組大鼠不同腦區病理形態學變化，常規HE染色正常對照組海馬結構完整，細胞排列整齊，形態正常，分布均勻。NESs組和IGF-1/NSCs組海馬可見少量膠質細胞增生，損傷的神經元開始修復;尤其以IGF-1/NSCs組明顯，多數受損的神經組織得到修復接近于正常，少見細胞凋亡改變。模型組海馬椎體細胞帶紊亂、變稀、中斷，同時可見許多細胞體積縮小，胞核固縮，染色加深。見圖2。

圖2 各組AD大鼠腦區病理改變(×100)

3 討論

NSCs的發現使人們對神經系統再生機制和神經系統疾病的治療均有了新的認識。NSCs因為具有強大的自我復制及產生多種不同類型子細胞的能力，使其成為良好的供者來源。IGF-1是一種多功能細胞增殖調控因子，其功能行使主要靠與IGF-1受體結合來完成。IGF-1受體在胚胎及成年大腦中廣泛存在，表明它與中樞神經系統的生長發育關系密切。在老年動物中樞神經系統中，尤其是海馬結構中IGF-1表達呈年齡相關性下降，而IGF-1有著類似于神經生長因子的促進神經突觸形成和維持神經細胞功能的作用，可改善老齡動物的記憶，學習能力〔10〕。有研究表明外源性IGF-1通過催化乙酰膽堿的形成，保護膽堿能神經元，從而改善腦功能，提示IGF-1在以智能喪失和行為異常為主要表現的老年性癡呆的治療中可能具有一定的臨床意義。

本實驗結果表明:大鼠海馬CA1區注射Aβ后，大鼠的空間學習記憶能力明顯下降，NSCs和IGF-1基因修飾后的NSCs移植后，AD模型大鼠的學習記憶能力有不同程度的改善，其中NSCs組兩項指標與模型組大鼠比較有統計學差異，顯示移植NSCs對AD模型大鼠的學習記憶力有一定的改善作用，這可能與NSCs分泌某些神經營養因子或增加腦細胞有關。IGF-1/NSCs組兩項指標差異最為明顯，都接近于正常組大鼠，它對基底前腦膽堿能神經元的保護作用也最強，這與移植細胞分泌有活性的IGF-1，促進海馬膽堿能系的存活和修復有關。

1 Abrous DN，Koehl M，Le Moal M.Adult neurogenesis:from precursors to network and physiology〔J〕.Physiol Rev，2005;58(2):523-69.

2 Haughey NJ，Nath A，Chan SL，et al.Disruption of neurogenesis by amyloid-peptide，and perturbed neural progenitor cell homeostasis，inmodels of Alzheimer disease〔J〕.J Neurochem，2002;83(6):1509-24.

3 Mustafa A，Launfelt L.Decreased plasma insulin-like growth factor-1 level in familial Alzheimer disease patients carrying the Swedish APP 670/671 mutation〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，1999;10(6):446-51.

4 Rivera EJ，Goldin A，Fulmer N，et al.Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer disease:link to brain reductions in acetylcholine〔J〕.J Alzheimers Dis，2005;8(3):247-68.

5 王 進，崔景彬，張亞卓，等.胰島素樣生長因子-1基因真核表達載體的構建〔J〕.解剖學報，2006;37(2):187-9.

6 Snnag WE，Lynch C，Thomton P，et al.The effects of growth hormone and IGF-1 defficency on cerebrobascular and brain ageing〔J〕.J Anat，2000;197(4):575-85.