基質金屬蛋白酶-2與結直腸癌浸潤和轉移的相關性

周艷紅 (唐山職業技術學院基礎醫學部，河北 唐山 063000)

基質金屬蛋白酶(MMPs)是含有9種酶蛋白分子的家族，可以導致基質膜和細胞間質成分破壞與降解，在惡性腫瘤的侵襲與轉移中發揮重要作用。近年來研究證明MMP-2在腫瘤的浸潤和轉移中起了關鍵作用〔1〕。本研究擬探討MMP-2與結直腸癌發生、發展、浸潤和轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取唐山市協和醫院2005～2007年間資料齊全的結直腸癌標本存檔蠟塊53例，正常人黏膜組織37例;年齡41～75(平均56)歲;以上標本均經病理證實?；颊咝g前均未進行放療、化療或激素治療。結直腸癌臨床分期采用TNM方案。Ⅰ期+Ⅱ期22例，Ⅲ期+Ⅳ期31例。淋巴結轉移陽性33例，淋巴結轉移陰性20例。

1.2 試劑 Trizol為美國 Promega公司產品。引物由大連寶生物公司合成，RT-PCR試劑盒為大連寶生物公司產品。其他試劑均為國產分析純。兔抗人MMP-2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) ①RNA提取和逆轉錄:參照Trizol試劑說明書進行，取1 μg總RNA為模板，逆轉錄成cDNA。②PCR:應用Omiga2.0設計 MMP-2和β-actin引物，見表1。按RT-PCR試劑盒操作，循環條件:預變性94℃2 min;變性94℃ 30 s;退火55℃ 30 s;延伸72℃ 45 s;35個循環后72℃延伸5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，結果用凝膠自動成像2000系統掃描，并以β-actin校正作相對量分析，數值以兩者吸光度的比值表示。

表1 PCR引物

1.4 免疫組織化學檢測 采用SP法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，用已知的結直腸癌癌陽性組織切片做陽性對照，用PBS代替一抗做空白對照。

1.5 結果判定 陽性反應判定標準依據陽性細胞數和陽性反應強度兩項指標:陽性著色細胞數＞15%定為陽性表達;陽性反應強度以淺黃色為弱陽性(+)、黃色或棕黃色為中等陽性()，棕色或者深棕色為強陽性())，無棕黃色或與背景著色一致為陰性(－)。

2 結果

2.1 MMP-2 mRNA在結直腸癌中的表達 結直腸癌組織中MMP-2 mRNA水平(0.821 8±0.033 75)明顯高于正常結直腸黏膜組織(0.671 2±0.025 05)，平均為正常結直腸黏膜組織的1.22倍(以 MMP-2/β-actin灰度比值代表 MMP-2之 OD值)(t=7.060，P ＜0.01)，見圖1。

圖1 結直腸癌及正常結直腸黏膜組織中MMP-2 mRNA表達

2.2 MMP-2蛋白在結直腸癌中的表達 MMP-2陽性表達部位主要在細胞質中，呈棕黃色顆粒，細胞膜有少量表達。與正常黏膜組比較，結直腸癌組MMP-2陽性表達率呈上升趨勢〔3例(8.1%)vs 40 例(75.5%)〕(χ2=16.729，P ＜0.01)。

2.3 MMP-2與結直腸癌臨床病理參數之間的關系 MMP-2在高、中、低分化癌組織中的表達分別為75.0%(15/20)、70.0%(14/20)、84.6%(11/13)(χ2=0.913，P=0.633)，差異無統計學意義;MMP-2在淋巴結轉移陽性組表達率93.9%(31/33)顯著高于淋巴結轉移陰性組〔45.0%(9/20)〕(χ2=16.111，P=0.001);直腸癌Ⅲ+Ⅳ期中 MMP-2陽性表達率〔96.8%(31/33)〕顯著高于Ⅰ +Ⅱ期〔45.5%(10/22)〕(χ2=18.307，P=0.001)。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移是一個多環節多步驟的癌細胞與宿主細胞相互作用的連續過程，包括腫瘤細胞從原發灶脫離、侵犯周圍局部組織、進入循環系統、停留于已形成的血管床、外滲入靶器官間質以及在遠隔器官增生形成轉移灶等。MMPs是一族蛋白酶，在哺乳動物中有24個成員，參與細胞外基質降解，其表達異常與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關，成為研究惡性腫瘤侵襲轉移的熱點〔2〕。國內研究發現MMP-2在多種腫瘤組織中(如肺癌、胃癌、食管癌、卵巢上皮癌、宮頸癌等)表達水平均顯著高于相應正常黏膜組織，同時發現MMP-2水平與腫瘤分期及遠處轉移密切相關，提示MMPs與腫瘤進展相關，并指出了為腫瘤干預治療而對MMPs進行研究的重要性〔3～7〕。國外學者Roeb等〔8〕在對20例結腸癌、10例直腸癌患者進行研究時發現，結腸組織中MMP-2及MMP-9在腫瘤組織中水平均顯著高于相應正常黏膜組織，以MMP-9升高明顯;而在直腸腫瘤中，僅MMP-2水平顯著增高。本研究結果提示MMP-2與結直腸癌的發生發展有著密切關系，MMP-2高表達的患者，癌組織分化更低，更易發生淋巴結轉移。其具體的作用機制可能與參與細胞外基質降解密切相關。

1 馬 莉，張桂華，戚 鳳.基質金屬蛋白酶-2與腫瘤關系的研究進展〔J〕.現代醫藥衛生，2009;25(10):1524-5.

2 Benassi MS，Gamberi G，Magagnoli G，et al.Metalloproteinase expression and prognosis in soft tissue sacomas〔J〕.Ann Oncol，2001;12(1):75-80.

3 常延河，鄭素琴，伊 雪，等.KISS-1和MMP-2在非小細胞肺癌中的表達及其與轉移和預后的關系〔J〕.中國現代醫學雜志，2010;20(19):2937-40.

4 華 敏，朱 宏，馮亞東，等.MMP-2、Cox-2蛋白在胃癌中的表達及臨床意義〔J〕.南通大學學報(醫學版)，2010;30(5):319-21.

5 葉曉鋒，高 平，韓恩善，等.MMP-2和PTEN蛋白在食管鱗癌中表達及臨床意義〔J〕.寧夏醫學雜志，2010;32(11):980-1.

6 高義軍，韓 萍，戴 琪，等.MMP-2在卵巢上皮性癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.西部醫學，2010;22(11):2000-2.

7 羅曉華，龐 霞，張占薪，等.VEGF-C、VEGFR-3和MMP-2在宮頸癌組織中的表達及其與侵襲、轉移的關系〔J〕.中國婦幼保健，2010;25(36):5384-6.

8 Roeb E，Dietrich CG，Winograd R，et al.Activity and cellular origin of gelatinases in patients with colon and rectal carcinoma〔J〕.Cancer，2001;92(24):2680-91.