HPLC法測定紅豆杉細胞培養物中的α-萘乙酸

黃巧明，駱雪蘭，徐國熙，李干雄，劉志偉

廣東科倫藥業有限公司研發部，廣東梅州 514031

萘乙酸是一種生長素類性質的生長調節劑，其毒性小，且具有明顯的增產效果，因此在農業上得到廣泛應用，但日本、美國對其在農產品的殘留均有嚴格的限量。紫杉醇是從紅豆杉植物中提取的一種抗癌藥，由于紅豆杉植物資源短缺，梅興國等采用紅豆杉植物細胞培養技術生產紫杉醇［1］，在其生產過程中添加萘乙酸對生物量具有明顯的促進效果，而且在鮮細胞和培養液中的紫杉醇產量均有所增加，因此萘乙酸在紅豆杉細胞培養中也作為一種調節劑。

目前，國內對萘乙酸在水稻、水果和蔬菜中的殘留檢測已有報道，檢測方法主要有分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。本文采用了溶劑萃取前處理，高效液相色譜分離測定，分析了紅豆杉細胞培養物中的萘乙酸殘留狀況，結果準確可靠、靈敏度高，能符合農藥殘留的分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

Waters 515高效液相色譜儀、Waters 2487紫外檢測器(美國Waters公司)，UV-2401 PC紫外分光光度計(日本島津公司)，旋轉蒸發儀。

對照品:萘乙酸純度為99%(國藥集團化學試劑有限公司);乙腈為色譜級試劑;水為超純水;二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸和磷酸二氫鉀為分析純試劑，紅豆杉細胞培養液和鮮細胞由本單位提供。

1.2 樣品的處理和制備

培養液樣品:將鮮細胞用200目濾布過濾，濾液即為紅豆杉細胞培養液。精密量取50 mL培養液，加入50 mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，用乙醇溶解洗脫并定容5 mL，搖勻待分析。

鮮細胞樣品:精確稱取鮮細胞10 g，加50 mL乙醇浸泡30 min，并用超聲波振蕩15 min，細胞用濾紙過濾，加50 mL乙醇重復超聲三次，合并濾液經旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，加50 mL二氯甲烷和50 mL蒸餾水萃取，共萃取三次，二氯甲烷溶液減壓濃縮至干，用乙醇溶解洗脫并定容10 mL，搖勻待分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱:Nova-Pak C18柱(150 mm ×3.9 mm，5 μm);流速:1 mL/min;紫外檢測波長:281 nm;柱溫:30℃;流動相:體積比為50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調PH值為3.0);進樣體積為 5 μL。

1.4 加標回收率

精密量取培養液50 mL加入萘乙酸25 mg/L的標準溶液1 mL，精密稱取鮮細胞10克加入萘乙酸2.5 mg/L的標準溶液1 mL，按上述方法進行前處理和制備，設置3組平行處理，進行加標回收率實驗，結果見表1。

表1 樣品中萘乙酸的回收率實驗結果(n=3)Table 1 Recovery results of α-Naphthylacetic acid in sample(n=3)

1.5 樣品的測定

分別平行處理和制備5組細胞和培養液樣品，依上述色譜條件，測定5組樣品，用外標標準曲線法計算樣品中的萘乙酸含量，結果見表2，對照品和樣品的色譜圖見圖(1)(2)(3)，萘乙酸(1號峰)保留時間2.43 min左右。

表2 樣品的測定結果(n=5)Table 2 Determination results of sample(n=5)

圖3 細胞色譜圖Fig.3 The chromatogram of NAA in cell

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

精密稱取萘乙酸對照品適量，用乙醇配制成含萘乙酸為10 mg/L的標準溶液，對萘乙酸標準溶液和上述制備的培養液供試品進行紫外光譜掃描，發現萘乙酸標準溶液在281 nm的波長處有較大紫外吸收峰，而培養液樣品在281 nm附近紫外吸收較小，為了減少雜質干擾，以達到較好的色譜分離，同時提高靈敏度，選擇檢測波長為281 nm。

2.2 前處理方法的建立

采用液液萃取法對樣品進行前處理，比較簡便快捷。對二氯甲烷和乙酸乙酯二種溶劑分別萃取樣品進行比較，實驗結果表明，所得回收率基本一致，但二氯甲烷萃取所得的樣品在色譜圖中雜質干擾較少，因此，實驗前處理方法采用二氯甲烷和水進行液液萃取。

2.3 流動相條件的優化

據文獻［2］報道，采用流動相體積比為70∶30的甲醇-水(磷酸調PH值3.0)可使萘乙酸達到色譜分離，而本實驗試用了多種“甲醇-水”溶劑系統，萘乙酸均未能與樣品雜質達到色譜分離。而后，改用溶劑系統，通過多次實驗，結果以體積比50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調PH值3.0)為流動相，萘乙酸峰與干擾組分達到良好的色譜分離，滿足了分析要求。

2.4 線性關系的考察

精密稱取萘乙酸對照品適量，用乙醇配制成含萘乙酸為500 mg/L的儲備液，再精密量取適量用乙醇依次稀釋成濃度分別為 0.20、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L的標準溶液，在優化實驗條件下進行液相色譜測定，萘乙酸的質量在0.001～0.125 μg范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系，其回歸方程為 Y=(3.092×107)X-21920.943(r=0.9998)，其中Y為色譜峰峰面積，X為萘乙酸的量(μg)。

2.5 精密度、檢測限和回收率試驗結果

精密量取萘乙酸標準溶液5 μL注入色譜儀，重復測定5次，其峰面積的RSD為0.52%。儀器的最低檢出量為(S/n=5)0.001 μg，根據樣品處理量計算，培養液的檢出限為0.02 mg/L，鮮細胞的檢出限為0.2 mg/kg。萘乙酸在鮮細胞和培養液樣品中的加標回收率實驗表明，在該方法條件下，鮮細胞和培養液樣品中分別加入萘乙酸對照品，其平均回收率分別為87%和93%。相對標準偏差RSD分別為3.9%和3.3%。

3 結論

本實驗方法經過對樣品前處理方法和檢測波長的篩選，同時對流動相系統的優化，建立了簡便、快速、靈敏、準確測定紅豆杉細胞培養物中萘乙酸的高效液相色譜法。本方法可以監測紅豆杉細胞培養物中萘乙酸的殘留。同時，對于紅豆杉細胞培養生產紫杉醇過程中控制生長激素水平也具有重要的意義。

1 Mei XG(梅興國).Taxol Production by Taxus Cell Culture(紅豆杉細胞培養生產紫杉醇).Wuhan:Huazhong University of Science and Technology Publisher，2003.10-13.

2 Kong DY(孔德洋)，Shi LL(石利利)，Shan ZJ(單正軍)，et al.Determination of α-Naphthylacetic acid by ASE-GPC Coupled with HPLC.J instrum anal(分析測試學報)，2010，29:382-385.