低氘水對皮膚成纖維細胞及黑色素瘤細胞的影響

張亞茹，吳 晟，姜銀風，叢峰松*

1上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240;2上海家化聯合股份有限公司，上海市 200082

低氘水的生物學效應已經有很多文獻報道。最早Somlyai等［1］報道，低氘水可以抑制小鼠成纖維L929細胞的生長速率并且引起移植瘤小鼠腫瘤組織消退。俄羅斯研究人員最近［2-4］發現，如果把普通水中氘的體積分數減少65%，就會表現出一定的抗腫瘤特性，抑制瘤小鼠實驗結果也顯示，低氘水能抑制腫瘤生長，延長小鼠存活期。叢峰松［5］等報道，低氘水可以抑制肺癌移植瘤小鼠瘤體的生長。本文擬通過實驗研究低氘水對正常皮膚成纖維細胞增殖、乳酸代謝以及對黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性和黑色素生成等方面的影響，并研究低氘水對紫外輻射后受損細胞的修復作用，初步探討低氘水在化妝品方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

CCD-1095sk細胞和B16黑色素瘤細胞購自中科院細胞庫。低氘水(DDW)由上海池天超輕水生物工程有限公司提供，氘含量分別為25，50和105 ppm;Hyclone血清購自賽莫飛世爾生物制品有限公司;MTT試劑盒購自南京凱基生物有限公司;LD檢測試劑盒購自南京建成;MEM，RPM1640培養基粉劑購自GIBCO公司。酪氨酸酶(25KU)購自Worthington公司，L-Dopa購自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

人正常皮膚細胞株CCD-1095sk培養在含10%進口胎牛血清的MEM培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養。B16黑色素瘤細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養。

1.2.2 MTT 法測定 CCD-1095sk 細胞增殖

CCD-1095sk細胞(1×104個細胞/孔)接種于含100 μL培養液的96孔培養板中，對照組用正常MEM培養基培養，實驗組分別用25、50和105 ppm的低氘水配制的MEM培養基培養，處理8、10、12、24和48 h后，加入50 μL MTT溶液繼續培養4 h，吸凈培養液后，每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min，在490 nm波長條件下，測定各孔的吸光度OD值。每組設5個復孔。

1.2.3 LD試劑盒測定CCD-1095sk細胞乳酸代謝

收集對數期CCD-1095sk細胞，懸浮，分別取等量細胞懸液至于用25，50和105 ppm的低氘水配置的MEM培養基中，在8、10、24和48h檢測培養液中細胞代謝的乳酸含量。每組設三個平行對照。

乳酸(LD)含量=(測定管吸光度值-空白管吸光度值)÷(標準管吸光度值-空白光吸光度值)×標準濃度(3 mmol/l)×樣本稀釋倍數

1.2.4 體外酪氨酸酶活性測定［6，7］

根據酪氨酸活性測定參考文獻，在3 ml反應體系中，含有 0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.8)，以0.5 mmol/L L-DOPA作為測活底物，酪氨酸酶的終濃度為15.29 μg/mL。用分光光度計檢測475 nm波長處的光密度值隨著反應時間的變化，從直線部分的斜率換算出酶活力，消光系數ε為3700(mol/L·cm)-1。

1.2.5 細胞酪氨酸酶活性測定［8-10］

分別用 25、50和105 ppm的低氘水配置的1640培養基培養B16細胞，72 h后，棄上清。用pH 7.4的PBS洗滌細胞2次。每孔加10 ml/L的TrionX-100溶液90 μL，震蕩5 min溶解細胞。經37℃溫浴后，每空加1%L-Dopa 10 μL，繼續孵育30 min，于490 nm波長處檢測吸光度。每組設五個復孔。

酪氨酸酶活性抑制率=(1-各濃度平均吸光度值÷對照組平均吸光度值)×100%

1.2.6 黑色素含量測定［10，11］

采用改良的Hideya Ando方法，用不同濃度的低氘水培養B16細胞72 h后，調整細胞濃度至105個/mL。吸取細胞懸液分別置于離心管中，離心棄上清。用200 μL PBS緩沖液重懸細胞沉淀后，加入1 mL 1∶1乙醇乙醚液，在室溫下放置30 min。3000 rpm離心5 min后棄上清。加入1 mL含10%DMSO的 1mol/L NaOH溶液，80℃水浴45 min后于470 nm波長處測定吸光度值。每組設三個平行對照。

黑色素合成抑制率=［1-(藥物孔吸光度值÷藥物孔細胞密度)÷(對照孔吸光值÷對照孔細胞密度)］×100%

1.2.7 紫外損傷實驗

收集對數期CCD-1095sk細胞，調整細胞濃度為105個/mL。1(104個細胞/孔接種于含100 μL培養液的96孔培養板中，分別用25、50和105 ppm的低氘水配置的MEM培養基及正常MEM培養基培養4 h后，進行紫外照射。照射條件:UVC燈管功率15 W，波長254 nm，垂直照射距離20 cm，照射時間2 h。然后繼續培養8 h，用MTT檢測細胞的生長增殖情況。以不照射的細胞作為陽性對照組。每組設6個復孔。

1.2.8 統計學方法

數據均以means±SD表示，采用SPSS 11.0統計軟件包進行數據分析，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 低氘水對正常皮膚成纖維細胞CCD-1095sk的影響

用不同濃度的低氘水培養CCD-1095sk細胞，在培養的初期，低氘水表現為促進細胞生長。在8 h時，25 ppm和50 ppm的低氘水作用的細胞增殖率分別為102.27%和104.09%，與對照組相比較，差異具有統計學意義，P＜0.05，如圖1A，1B所示。在10 h時，25 ppm的低氘水作用的細胞增殖率為104.75%，與對照組相比較，差異具有統計學，P＜0.05。當培養至12 h以后，用低氘水培養的細胞逐漸開始出現生長抑制現象。當繼續培養至48 h時，低氘水又開始促進細胞生長。其中，105 ppm的低氘水作用最為明顯，增殖率為103.66%，與對照組相比較，差異具有統計學意義，P＜0.05，如圖1C所示。

圖1 不同濃度的低氘水對正常皮膚成纖維CCD-1095sk細胞增殖的影響Fig.1 Effects of DDW on the proliferation of CCD-1095sk cells.A:25 ppm DDW;B:50 ppm DDW;C:105 ppm DDW.*:P ＜0.05，vs control

2.2 低氘水對細胞CCD-1095sk細胞乳酸生成的影響

用不用濃度的低氘水培養CCD-1095sk細胞，取上清培養液檢測細胞代謝的乳酸(LD)的含量。結果顯示，培養至10 h時，用50 ppm和105 ppm的低氘水培養的細胞液中乳酸產量明顯低于正常對照組，乳酸產率分別為正常組的68.47%和85.87%，差異具有統計學意義，P＜0.05。培養至48 h時，用25 ppm和50 ppm的低氘水作用的CCD-1095sk細胞液中，乳酸產率分別為正常組的 81.22%和82.64%，差異具有統計學意義，P＜0.05，如圖2所示。實際乳酸的含量見表1。

圖2 不同濃度的低氘水對CCD-1095sk細胞LD生成的影響Fig.2 DDW affects contents of LD of CCD-1095sk cells.

表1 CCD-1095sk細胞LD含量(mmol/L)Table 1 LD content of CCD-1095sk cell(mmol/L)

2.3 DDW對酪氨酸酶活性的影響

在體外生化反應體系中，25 ppm與105 ppm的低氘水對酪氨酸酶活力抑制率為3.67%，50 ppm的低氘水對酪氨酸酶活力抑制率為11.89%，如Fig 3所示。

圖3 不同濃度的低氘水對酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effects of DDW on tyrosinase activity.

2.4 DDW對B16細胞酪氨酸酶活性的影響

用不同濃度的低氘水作用B16黑色素瘤細胞72 h后，以L-DOPA作為測活底物，檢測細胞中酪氨酸酶的活性。50 ppm和105 ppm的低氘水對酪氨酸酶的抑制率分別達到44.32%和24.51%，差異具有統計學意義，P ＜0.05，Fig 4。

圖4 不同濃度的低氘水對B16細胞酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effects of DDW on tyrosinase activity in B16 cells.

2.5 低氘水對B16細胞黑色素生成的影響

用不同濃度的低氘水作用B16黑色素瘤細胞72 h后，50 ppm的低氘水對B16細胞的黑色素生成的抑制率為39.59%，25 ppm和105 ppm低氘水對B16細胞的黑色素生成的抑制率分別為26.45%和24.61%，與對照組相比較，差異具有統計學意義，P＜0.05，如 Fig 5 所示。

圖5 不同濃度的低氘水對B16細胞黑色素生成的影響Fig.5 Effects of DDW on melanogenesis.

2.6 低氘水對受到紫外損傷細胞的修復作用

與陽性對照組相比較，經紫外照射的細胞受到損傷，細胞增殖降低了30.43%，差異具有統計學差異(P＜0.01)，說明紫外損傷的模型是成功的(陽性對照組細胞不經過紫外照射)。用不同濃度的低氘水作用經紫外照射的CCD-1095sk細胞，結果顯示，用50 ppm的低氘水培養的細胞增殖率為105.37%，與對照組相比較，差異具有統計學意義，P ＜0.05，如圖6所示。

圖6 低氘水對紫外損傷細胞增殖的影響Fig.6 Effects of DDW on cell proliferation after irradiation of UVC

3 結論

現代科學技術的飛速發展和廣泛應用給化妝品行業帶來全新的發展機遇，化妝品已從潔膚，潤膚為目的的基礎護膚品向延緩衰老，美化膚色為目的的功效性化妝品方向發展［12］。人們對化妝品的關注已經不再是單純的美麗動人，而是轉向其安全性。普通水中，氘和氕的比率(D/H)大約是1∶6600，即水中氘的體積分數為0.015%［13］。我們把氘體積分數低于0.015%的水稱為低氘水(deuterium-depleted water，DDW)。氘和氕由于質量不同導致氫的這兩種穩定同位素之間物理和化學性質的不同［14，15］。

皮膚的彈性、光滑等外觀一定程度上由構成皮膚不同組分的細胞的增殖和分裂所決定［16］。本次實驗結果表明，在細胞培養的初期，不同濃度的低氘水均表現出促進細胞增殖活力，同時細胞中乳酸的產量減少。

皮膚色調的主要因素是皮膚內的黑色素，膚色的深淺主要決定于黑色素細胞合成黑色素的能力［16］。酪氨酸酶 (tyrosinase)俗稱多酚氧化酶，普遍存在于人和動植物體內，是黑色素生物合成過程中必不可少的關鍵酶。它能將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌不穩定，可以經一系列的非酶促反應后，形成由5，6-二羥吲哚和 5，6-二羥吲哚-2-羧酸單元構成的異聚體-黑色素［17］。如果該酶活力過高，可形成黑色素瘤，因此引起了人們對酪氨酸酶的關注。體外生化實驗表明，三種不同濃度的低氘水能不同程度地抑制酪氨酸酶活性。細胞實驗證實，50 ppm和105 ppm的低氘水能顯著抑制B16細胞的酪氨酸酶活性，降低細胞黑色素生成量，差異具有統計學意義，P ＜0.05。

隨著臭氧層破壞的加重，到達地球表面的紫外線日益增多。紫外線輻射(UVR)會導致皮膚細胞的活性氧(ROS)增加，引起DNA和角膜損傷，促進皮膚光老化和癌變以及白內障、免疫抑制等疾病的發生［18-20］。Bild 等［21］人用 30 ppm 的低氘水喂養小鼠15天，然后用8.5 Gray的半致死量射線進行照射。對照組小鼠用普通水喂養，用同樣劑量的射線照射。結果顯示，實驗組的小鼠存活率為61%，而對照組小鼠的存活率僅有25%。我們實驗也證實:50 ppm的低氘水能促進受到紫外損傷的CCD-1095sk成纖維細胞的增殖生長，與正常對照組比較，差異具有統計學意義，P＜0.05。以上結果提示，低氘水對細胞DNA損傷具有一定修復作用，但其具體的分子機制尚需進一步研究。

1 Somlyai G，Jancsó G，Jákli G，et al.Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells，FEBS，1993，317:1-4.

2 Siniak IuE，Turusov VS，Grigorev AI，et al.Consideration of the deuterium-free water supply to an expedition to Mars.Aviakosam Ekolog Med，2003，37(6):60-63.

3 Turusov VS，siniak IuE，Grigor＇ev AI，et al.Low-deuterium water effect on transplantable tumors.Vopr Onkol，2005，51:99-102.

4 Tyrysov VS，Siniak IuE，Antoshina EE，et al.The effect of preliminary administration of water with reduced deuterium content on the growth of transplantable tumors in mice.Vopr Onkol，2006，52:59-62.

5 Cong FS，Zhang YR，Wang JY，et al.Inhibitory effect of deuterium-depleted water on proliferation of lung carcinoma cells and the possible mechanism.Chin J Cancer Biotherapy，2009，16，484-489.

6 Qiu L，Chen Qx，Wang Q，et al.Irreversibly inhibitory kinetics of 3，5-dihydroxyphenyl decanoate on mushroom(A garicus bisporus)tyrosinase.Bioorganic＆ Medicinal Chemistry，2005，13:6206-6211.

7 Zhuang JX，Qiu L，Zhong X，et al.Inhibitory Effect of Ginkgolic Acids GA1 on Mushroom Tyrosinase and B-16 Cell.J Xiamen Univ，Nat Sci，2009，48:103-106.

8 Emest V，Cecil K，Heino H，et al.Inhibitors of mammalian Melanocyte tyrosinase:in vitro comparisons of alkyl esters of gentisic acid with other putative inhibitors.Biochem Pharm，1999，57:633.

9 Nakajima M，Shinoda I，Fukuwatari Y，et al.Arbutin increases the pigmentation of cultured melanocytes through mechanisma other than the induction of tyrosinase activity.Pigment Cell Res，1998，11:12.

10 Ma JB，Feng SF，Li F，et al.Effects of Glabridin on B16 Cell Metablism.Fudan Univ J Med Sci，2003，，30:353-355.

11 Hidey A，Akira I，Yutaka M，et al.Correlation between the number of malanosomes，tyrosinase mRNA levels，and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cell in response to various melanogenesis regulatory agents.J Cellular Physiol，1995，163:608.

12 Yan SX(閻世翔).化妝品科學.Beijing:Science Academic Press.1995

13 Yurtsever Y and Gat JR.Stable Isotope Hydrology(JR Gat and R Gonfiantini，Eds.)，International Atomic Energy A-gency，Vienna，1981，103-142.

14 Collins CJA and Bowman NS(Eds):Isotope Effects in Chemical Reactions.Van Nostrand Reinhold，New York，1971.

15 Winberg KB.The deuterium isotope effect.Chem Rev，1955，55:713-43.

16 Wang ZM，Li L，Guo SY.Application of bioactive polysaccharides in cosmetics.China Surfactant Detergent＆ Cosmetics，2004，245-248.

17 Sánchez-Ferrer A，Rodríguez-López JN，García-Cánovas F，et al.Tyrosinase:a comprehensive review of it’s mechanism.BBA-protein and Molecular Enzynology，1995.1247:1-11.

18 Kim TY.Kripke ML，Ullrich SE.Immunosuppression by factors released from UV-irradiated epidermal cells:selective effects on the generation of contact and delayed hypersensitivity after exposure to UVA or UVB radiation.J Invest Dermatol，1990，94:26-32.

19 Moan J，Peak M J.Effects of UV radiation of cells.J Photochem Photobiol B，1989，4:21-34.

20 Shimmura S，Suematsu M，Shimoyama M，et al.Subthreshold UV radiation-induced peroxide formation in cultured corneal epithelial cells:the protective effects of lactoferrin.Exp Eye Res，1996，63:519-526.

21 Bild W，Stefanescu I，Haulica I，et al.Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water.Romanian J Physiol，1999，36:205-218.