彝族蟲類藥日本琵琶甲的化學(xué)成分研究

晏永明，呂 青，董小萍 ，李 艷，程永現(xiàn) *

1中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204;2成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610075

日本琵琶甲(Blaps japonensis Marseul.)屬鞘翅目(Coleoptera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲族(Blaptini)琵琶甲屬(Blaps)昆蟲。日本琵琶甲又稱臭殼子、臭屁蟲、打屁蟲等，在云南民間應(yīng)用廣泛，尤其是彝族治療疑難雜癥處方中常用的藥用昆蟲，具有抗菌、消炎、解毒、消包塊、抗驚癇等作用［1］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其化學(xué)成分及生物活性研究較少，已有的研究表明同屬昆蟲中含有一些對(duì)苯二酚類和脂溶性成分等［2-5］。我們采用各種柱色譜從其50%乙醇提取物的正丁醇萃取部位分離得到10個(gè)化合物，所有化合物均系首次從該藥用昆蟲中分離得到。活性測(cè)試表明化合物1具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生作用。

1 儀器與材料

JASCO-20C型數(shù)字式旋光儀(日本);VG AUTO Spec-3000(英國(guó)VG公司)及Finnigan MAT 90質(zhì)譜儀(德國(guó) Finnigan公司);Bruker AM-400及 DRX-500 MHz核磁共振儀(TMS作為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm，J為Hz);200～300目柱色譜用硅膠、硅膠H和GF254薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司產(chǎn)品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia公司);40 ～63 μm RP-18(日本Daiso)。石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有機(jī)溶劑均為工業(yè)純經(jīng)重蒸后使用。

日本琵琶甲樣品購(gòu)自云南花鳥市場(chǎng)(采集自云南元江)，由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董大志研究員鑒定，標(biāo)本(CHYX-0469)存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

日本琵琶甲5 kg，粉碎，50%乙醇冷浸動(dòng)態(tài)提取3次，每次2 d，過濾，減壓回收乙醇得浸膏450 g，加水懸浮后依次用石油醚和正丁醇進(jìn)行萃取，合并正丁醇萃取液，濃縮得到正丁醇部位140 g。正丁醇部位經(jīng)硅膠柱色譜 (200～300目，1.5 kg)以氯仿－甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組份 (Fr.1～Fr.5)。各組份經(jīng)硅膠、MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18反復(fù)柱層析，結(jié)合制備薄層色譜從由Fr.1獲得9(20 mg)、7(10 mg)和 8(7 mg);Fr.2 獲得 2(20 mg)、4(10 mg)和 6(12 mg);Fr.3 獲得 1(5 mg)，F(xiàn)r.4 獲得3(40 mg)和10(5 mg)，F(xiàn)r.5 獲得5(12 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1的主要HMBC和COSY相關(guān)Fig.1 Key HMBC and ROESY correlations of compound 1

3，4-Dihydroxyphenylacetic acid methyl ester(2)白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.72-6.59(3H，m，Ar-H)，3.49(2H，s，H-1')，3.63(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:125.9(C-1)，115.5(C-2)，143.1(C-3)，143.8(C-4)，116.3(C-5)，121.6(C-6)，40.4(C-1')，173.8(C-2')，52.4(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［7］。

Hydroxytyrosol(3) 白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.70(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.69(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6)，2.63(2H，t，J=7.2 Hz，H-1')，3.65(2H，t，J=7.2 Hz，H-2')，7.81(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.7(C-1)，116.8(C-2)，144.1(C-3)，145.6(C-4)，115.9(C-5)，120.9(C-6)，39.6(C-1')，64.2(C-2')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值基本相符［8］。

3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol(4)白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.80(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.63(1H，dd，J=7.8，2.1 Hz，H-6)，4.08(1H，dd，J=7.9，4.0 Hz，H-1')，3.55(1H，dd，J=11.3，8.2 Hz，H-2'a)，3.43(1H，brd，J=10.7 Hz，H-2'b)，3.58(1H，brs，2'-OH)，3.18(3H，s，OCH3)，7.88(1H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.1(C-1)，115.8(C-2)，145.5(C-3)，145.9(C-4)，114.7(C-5)，119.5(C-6)，86.7(C-1')，67.8(C-2')，56.6(OCH3)。以上數(shù)據(jù)鑒定化合物4結(jié)構(gòu)為3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol，并對(duì)其核磁共振數(shù)據(jù)首次進(jìn)行了歸屬。

(S)-(+)-2-(3，4-Dihydroxy phenyl)-2-ethoxylethanol(5) 白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.81(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.65(1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6)，4.20(1H，d，J=8.0，4.1 Hz，H-2')，3.37(4H，m，H-1，H-1'')，1.11(3H，t，J=7.0 Hz，H-2'')，3.66(1H，brs，2'-OH)，7.88(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.6(C-1)，114.6(C-2)，145.8(C-3)，145.4(C-4)，115.8(C-5)，119.3(C-6)，67.9(C-1')，83.7(C-2')，64.5(C-1'')，15.6(C-2'')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［9］。

3-Hydroxy-4-methoxy-phenylmethylcarbinol(6)白色固體。1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δ:6.67(1H，d，J=3.0 Hz，H-2)，6.60(1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.6，3.0 Hz，H-6)，4.65(1H，q，J=6.5 Hz，H-1')，1.33(3H，d，J=6.5 Hz，H-2')，3.23(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.1(C-1)，115.6(C-2)，148.8(C-3)，151.4(C-4)，113.6(C-5)，117.1(C-6)，75.8(C-1')，22.6(C-2')，56.7(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［10］。

4-Hydroxybenzoic acid(7) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.71(1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，7.79(1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:127.7(C-1)，132.5(C-2，6)，115.5(C-3，5)，161.6(C-4)，174.1(COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［11］。

原兒茶醛(8) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.30(2H，brs，H-2，6)，6.91(1H，brd，J=5.1 Hz，H-5)，9.67(1H，s，CHO);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:130.7(C-1)，116.2(C-2)，147.1(C-3)，153.7(C-4)，119.4(C-5)，126.5(C-6)，193.1(CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［12］。

Ethyl β-D-xylobioside(9) 白色固體。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.14(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.1 Hz，H-3)，3.50(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.21(1H，dd，J=11.0，9.8 Hz，H-5b)，3.80(2H，m，C-1')，1.14(3H，t，J=7.2 Hz，C-2');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.3(C-1)，74.2(C-2)，77.3(C-3)，70.8(C-4)，66.0(C-5)，65.0(C-1')，15.4(C-2')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［13］。

Butyl β-D-xylobioside(10)白色固體。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.15(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.2 Hz，H-3)，3.45(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.17(1H，m，H-5b)，3.79(2H，m，C-1')，1.52(2H，m，H-2')，1.35(2H，q，J=7.6 Hz，H-3')，0.88(3H，t，J=7.4 Hz，H-4');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.5(C-1)，74.1(C-2)，77.1(C-3)，70.7(C-4)，66.0(C-5)，69.4(C-1')，32.5(C-2')，19.8(C-3')，14.1(C-4')，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［13］。

4 活性測(cè)試

化合物1為具有五元不飽和內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)，為此我們對(duì)其進(jìn)行了生物活性測(cè)試。應(yīng)用脂多糖(LPS)和 IFN-γ刺激 RAW264.7細(xì)胞，然后應(yīng)用Griess試劑測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2-水平以反映誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的總體酶活。采用MTT［14］法測(cè)定細(xì)胞存活量，應(yīng)用 Reed and Muench［15］法計(jì)算化合物的IC50值。結(jié)果表明化合物1可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7產(chǎn)生一氧化氮，其IC50值為14.8 μg/mL，提示化合物1可能具有抗炎或抗腫瘤作用，與該昆蟲的傳統(tǒng)功效有密切關(guān)聯(lián)。

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