c-met在喉鱗狀細胞癌中的表達及意義

彭春麗，黃 瑋，萬保羅，馬 嵩

(1.河南中醫學院 河南鄭州 450003;2.河南省衛生廳 河南鄭州 450003;3.河南省人民醫院耳鼻喉科 河南鄭州 450003)

喉癌(carcinoma of the larynx)是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1% ～5%，其病理上以鱗狀細胞癌多見。近年來發病率呈上升趨勢，其發病機制不完全清楚。c-met是一種由c-met原癌基因編碼的蛋白產物，為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)受體，具有酪氨酸激酶活性。研究發現異常表達的c-met可以激活下游分子導致腫瘤的發生、發展和轉移。本研究旨在從蛋白水平觀察c-met在喉癌組織及非癌組織中表達情況，為進一步深入研究喉癌的發生發展機制及腫瘤治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集42例河南省人民醫院和鄭州大學第一附屬醫院2008年至2009年手術切除的喉癌標本，均有完整臨床資料，經組織病理學均確診為喉鱗狀細胞癌。患者術前均未接受化療或放療。其中男41例，女1例，年齡38～80歲，平均59歲，≥60歲18例，＜60歲24例。42例喉鱗癌TNM分期采用國際抗癌協會(UICC)1977年公布的標準進行:T分期:T1:3例，T2:17例，T3:17例，T4:5例。細胞分化程度:高分化:22例，中分化:14例，低分化:6例。臨床分期:Ⅰ期:3例，Ⅱ期:10例，Ⅲ期:22例，Ⅳ期:7例。頸部淋巴結轉移組15例，無轉移組27例。另取25例非喉鱗癌組織(癌旁組織和聲帶息肉)作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人c-met多克隆抗體購自博奧森生物技術公司。MaxVision試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(DAB-0031)均購自邁新生物技術公司。

1.3 實驗方法 所有標本均經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4厚連續切片;拷片后脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2孵育10 min，高壓抗原修復20 min;MaxVision二步法進行染色，DAB顯色，蘇目素復染，脫水，透明，中性樹脂封固。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，陽性對照采用預實驗中已知陽性的喉鱗癌切片做陽性對照。

1.4 結果判斷 c-met陽性著色定位于細胞質，陽性染色為棕黃色顆粒。采用雙盲法，每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野(10×40)，每高倍鏡視野計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率:陽性細胞＜5%為(－);陽性細胞在5% ～25%為弱陽性(+);陽性細胞數在25% ～50%為陽性(++);陽性細胞≥50%為強陽性(+++)。

1.5 統計學分析 應用采用應用SPSS17.0版統計軟件包進行數據統計分析。兩組差異的比較用χ2檢驗和Fisher精確概率法，相關性分析用Spearman等級相關檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 c-met在LSCC、癌旁組織或聲帶息肉中的表達c-met陽性著色見于細胞質，c-met在喉癌組織、非癌組織(癌旁組織及聲帶息肉)中均有表達，其陽性表達率分別為 64.3%、32.0%。見表 1。

表1 c-met在LSCC、非癌組織的表達

2.2 c-met在LSCC中表達與臨床病理特征間的關系 c-met在 T1、T2期喉癌中的陽性表達率與在T3、T4期LSCC中的陽性表達率有顯著性差異(P＜0.05);c-met在高、中、低分化LSCC三組間的陽性表達率有統計學差異(P＜0.05);c-met在Ⅰ ～Ⅱ期LSCC中的陽性表達率與在Ⅲ～Ⅳ期LSCC中的陽性表達率間差異有統計學意義(P＜0.05);c-met在有淋巴結轉移組的陽性表達率與無淋巴結轉移組的陽性表達率間有顯著性差異(P＜0.05)。c-met在喉癌中的陽性表達率與患者的年齡無關(P＞0.05)。見表2。

表2 c-met在LSCC中表達與臨床病理特征間的關系

3 討論

c-met是一種由c-met原癌基因編碼的蛋白產物，為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)受體，具有酪氨酸激酶活性，編碼HGF受體，是細胞內信息傳遞的重要組成成分。HGF激活c-met，導致多個信號轉導途徑的級聯激活，細胞發生一系列生物學效應，從而調節多種細胞的增殖、分化、運動、侵襲以及最終轉移等［1］。在體內，HGF主要由間質細胞分泌，HGF與受體c-met結合將激活HGF/c-met信號通路，促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。研究表明c-met激活與多種腫瘤的發生、發展和轉移有關。

原癌基因 c-met位于第7號染色體長臂7q31，大小約110 kb，包含21個外顯子和20個內含子［2］，屬于酪氨酸激酶受體家族之一。其編碼9.0 kb mRNA，編碼的前體蛋白分子量為140 kD，經糖基化作用產生170 kD的糖蛋白，進而切割成50 kD的α亞基和145 kD的β亞基，兩個亞基以二硫鍵相形成190 kD的成熟受體蛋白，位于細胞膜上，β亞基有胞外區、跨膜區和胞內區，N末端部分為暴露于細胞表面的配體結構域，C末端部分位于胞漿內。α亞基只有胞外部分，借助于二硫鍵附于β亞基上。α和β亞基的胞外區是配體識別部位 ，可以識別并結合肝細胞生長因子(HGF)，而胞內區具有酪氨酸激酶活性 ，是多種信號分子相互作用的結合部，該受體蛋白具有經典的信號肽序列、細胞外位點結構、跨膜位點結構以及酪氨酸激酶位點結構［3，4］。正常表達的 c-met對胚胎的生長發育、組織的再生、傷口的愈合等起著重要的作用。Bussolino［5］等研究證明血管內皮細胞能表達c-met，HGF能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和參與內皮細胞損傷的修復機制。同時，Huriguchi［6］等研究也證明HGF不僅可以通過自分泌或旁分泌途徑直接作用于內皮細胞，而且促使其他血管生長因子的水平升高(如VEGF)，間接促進腫瘤血管生成導致腫瘤生成與轉移。除此之外，HGF/c-met還能增加內皮細胞表達血管生成反應的介質包括VEGFR2RTK［7］。在肝細胞癌、神經膠質瘤、乳腺癌肺癌中研究發現，HGF/c-met的表達與毛細血管密度(microvessel density)呈正相關［8］。研究還發現，HGF可以促進多種腫瘤細胞的運動能力。Royal［9］等對MDCK上皮細胞研究發現，HGF可以影響上皮細胞與間質的相互作用，導致上皮細胞的分離和擴算，這在腫瘤侵襲轉移過程中極為重要。C-met的異常激活還可增加腫瘤細胞對細胞外基質(ECM)的降解。眾多研究也證明，c-met蛋白在多種惡性腫瘤中表達異常，如肝細胞癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌、結腸癌等，且表達的水平與腫瘤的惡性程度呈正相關.說明c-met與多種惡性腫瘤發生、發展密切相關［10，11］。

本實驗應用敏感的MaxVision免疫組化二步法檢測了c-met蛋白在喉鱗癌及非癌組織中的表達。在本實驗研究結果中，c-met在LSCC中的陽性表達率為64.3%，而在25例對照組的表達率為32.0%，兩組間的陽性表達率有顯著性差異(P＜0.05)，有顯著統計學意義，表明c-met在喉鱗癌的發生、發展中起重要作用。這與 Sawatsubashi［12］的實驗結果相符。在 T1、T2期喉癌中的c-met陽性表達率為45.0%，而在 T3、T4期LSCC中的陽性表達率為81.8%，兩組有顯著性差異(P＜0.05);c-met在Ⅰ～Ⅱ期LSCC中的陽性表達率為38.5%，在Ⅲ～Ⅳ期LSCC中的陽性表達率為75.9%，兩組間有差異(P＜0.05)，且隨著T分期與臨床分期的進展，c-met蛋白陽性表達呈上升趨勢，;cmet在高、中、低分化LSCC中的陽性表達率分別為45.5%、78.6%、100.0%，3 組間有顯著性差異(P ＜0.05)，喉鱗癌細胞分化程度越高，c-met蛋白的陽性表達越低;c-met在有淋巴結轉移組的陽性表達率為86.7%，在無淋巴結轉移組的陽性表達率為51.9%，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)，有淋巴結轉移者明顯高于無淋巴結轉移者。這與大多數研究結果一致，龔健靈等［13］利用免疫組化法檢測喉鱗癌中c-met表達率為62.2%，明顯高于癌旁正常組織的16%;c-met蛋白的表達與喉癌的臨床分期、病理學分級、淋巴結轉移均有顯著差異(P＜0.05)。王冰等［14］利用免疫組化檢測46例喉鱗癌與25例正常喉粘膜中c-met的表達情況，結果顯示c-met在喉鱗癌中高表達，c-met表達與臨床分期、病理分級及淋巴結轉移明顯相關。這些結果提示c-met蛋白在腫瘤的發生、發展及侵襲轉移中發揮重要作用，因此阻斷HGF/C-met系統的配對表達和信號轉導可作為抗腫瘤侵襲和轉移治療的策略之一。

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