兩種酶標抗體制備方法的比較及李斯特菌TAS ELISA試劑盒性能的優化

劉雅莉，劉 芳，劉 箐，韓舜愈，孫志博，夏俊芳，朱小清

(1.蘭州大學第二醫院，甘肅蘭州730030;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;3.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093;4.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛生保健中心，甘肅蘭州730020;5.蘭州大學基礎醫學院，甘肅蘭州730000;6.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅蘭州730020)

兩種酶標抗體制備方法的比較及李斯特菌TAS ELISA試劑盒性能的優化

劉雅莉1，2，3，劉 芳4，劉 箐3，*，韓舜愈2，孫志博5，夏俊芳2，朱小清6

(1.蘭州大學第二醫院，甘肅蘭州730030;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;3.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093;4.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛生保健中心，甘肅蘭州730020;5.蘭州大學基礎醫學院，甘肅蘭州730000;6.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅蘭州730020)

研制一種低成本、快速、準確的三抗體夾心酶聯免疫(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)檢測試劑盒。采用戊二醛法、改良過碘酸鈉法分別制備堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG，比較單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)TAS-ELISA試劑盒兩種酶標抗體的檢測效果，并考察了試劑盒的檢測靈敏度、特異性、穩定性、保存周期等指標。結果表明，采用改良過碘酸鈉法制備的HRP-IgG效果好，克分子比最高可達2.9，酶結合率達27%;試劑盒檢測周期6h，檢測成本為3.5元/孔，特異性實驗、干擾實驗、重復性實驗、穩定性實驗表明采用該方法制備的酶標抗體，特異性好、結果穩定可靠。自制TAS-ELISA試劑盒檢測性能可達到商業化試劑盒水平，為該產品的產業化提供了一定的理論依據。

單核細胞增生性李斯特菌，改良過碘酸鈉法，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，三抗體夾心ELISA

Abstract:To develop a low-cost，rapid and accurate TAS-ELISA KIT.This study preparated AP-IgG and HRP-IgG by glutaraldehyde method and improved periodate method respectively and compared two enzyme conjugates of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT，further investigated some indexes including the sensitivity，specificity，stability，shelf life.The results showed that HRP-IgG preparated with improved periodate method was more effective，the molar ratios was 2.9，the rate of enzyme-labeled was 27%.The detection time of KIT was 6h，the detection cost was ￥3.5/well.Specific experiment，interference experiment，repetitive experiment and stable experiment indicated that the HRP-IgG preparated with improved periodate method was specific and reliable.The performance of self-made TAS-ELISA KIT could reach commercial KIT，it also could provide theoretical basis for industrialization of the product.

Key words:Listeria monocytogenes;improved periodate method;AP;HRP;TAS-ELISA

單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是WHO公認的四大食源性致病菌之一，已被許多國家列為食品安全零檢出項目。目前針對LM的檢測方法主要有傳統微生物培養、膠體金試紙條、ELISA、PCR、免疫捕捉 PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、免疫磁珠PCR、PCR-變性高效液相色譜、PCR-核酸層析、基因芯片、電子鼻、環介導等溫擴增［1-10］等，這些檢測手段或操作繁瑣、或特異性不強、或成本過高，嚴重影響了檢測質量，降低了檢測效率，延長了檢測時間，增加了檢測成本;ELISA方法是實驗室最為常用的檢測手段，但是目前針對食源性致病菌的ELISA全套試劑盒需從國外公司購買，檢測成本高，嚴重制約了ELISA試劑盒在我國食品安全檢測中的普及;因此，本研究旨在建立一種成本低廉、穩定性好、適于國內試劑盒產業化的酶標抗體的方法。ELISA分為間接 ELISA(Indirect ELISA)、競爭ELISA(Competitive ELISA)、雙抗體夾心ELISA(DoubleantibodiessandwichELISA，DASELISA)、三抗體夾心ELISA(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)，其中以 DAS-ELISA和 TASELISA最為常用。與DAS-ELISA相比，TAS-ELISA具有以下優點:a.TSA-ELISA進行酶標記的抗體是通用的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，它可以結合所有兔源或鼠源的抗體，這樣只需一株酶標羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，即可滿足所有相關試劑盒檢測抗體需求，大大降低了實驗成本;DAS-ELISA需要對第二株抗體進行酶標記，由于不同抗體的特殊性，無法保證酶標抗體的質量和穩定性，若購買進口酶標檢測抗體，則大大增加了檢測成本;b.TSA-ELISA在DASELISA雙抗體夾心的基礎上，采用第三株酶標抗體進行酶促反應，特異性比DAS-ELISA好，可以減少假陽性、假陰性的出現。本研究采用戊二醛法、改良過碘酸鈉法分別制備堿性磷酸(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG，并比較了兩種方法的優缺點，建立了一種適用于食品中LM的TAS-ELISA檢測試劑盒的抗體酶標技術，為該試劑盒在我國的產業化提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性磷酸酶(500U) 寶生物工程(大連)有限公司;辣根過氧化物酶(RZ＞3.0) 蘭州鵬程生物;BCA蛋白濃度測定試劑盒 碧云天公司;過碘酸鈉Sigma公司;LM單克隆抗體(ab11439)、多克隆抗體(ab20506) Abcam公司;山羊抗兔 IgG抗體(SA27) Solarbio公司;HRP-羊抗兔抗體 中杉金橋。

全自動酶標儀MK3 芬蘭雷勃公司;高速離心機3K30 Sigma公司;磁力攪拌器RCT基本型 IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梯度菌液、模擬帶菌菌液、底物溶液的制備LM標準菌株用腦心浸液肉湯培養后稀釋101～108倍，并進行平板計數(各梯度純菌懸液分別設3個重復)，梯度菌液計數結果為 1.37×109～1.37×101cfu/mL。

選取易受LM污染的6種食品(牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉)各25g碾碎并與250mL無菌磷酸鹽緩沖液混合，以此為稀釋液梯度稀釋LM純菌液，制備梯度模擬菌液。

HRP顯色底物溶液(四甲基聯苯胺，TMB)的配制。A液:3mg/mL TMB(30mgTMB粉末、10mL二甲基亞砜);B液:檸檬酸溶液(檸檬酸 4.41g、Na2HPO4·12H2O 20.77g、無菌水 500mL、pH5.5)。使用前將A液1mL、B液19mL混合并加入14μL雙氧水混勻備用。

1.2.2 山羊抗兔IgG抗體濃度的測定 用生理鹽水將山羊抗兔IgG抗體稀釋不同倍數(100、500、1000倍)，同時用生理鹽水作陰性對照，采用BCA試劑盒測定抗體濃度，操作方法參照試劑盒說明書(編號P0012)。

1.2.3 戊二醛法制備AP-羊抗兔IgG 280μL PBS中加入 20μL AP、2.4μL戊二醛混勻后室溫靜置3～5h;取混合液裝入透析袋 PBS中 4℃冰箱透析18h;次日將透析袋中液體小心吸出，并加入山羊抗兔IgG，混勻后室溫靜止5h;再次PBS 4℃冰箱透析18h，吸出酶標抗體備用。

1.2.4 改良過碘酸鈉法［11］制備HRP-羊抗兔IgG取5mg HRP溶于2mL無菌水中，并加入NaIO4若干，0℃放置若干分鐘;混合液于醋酸鈉緩沖液中4℃透析12～24h;小心吸出混合液，加入乙二醇若干，0℃封閉1h;混合液加入山羊抗兔IgG若干，于CB緩沖液中4℃透析12～24h;結合物加入 NaBH4若干量，4℃還原3h;加入等體積飽和硫酸銨，4℃鹽析24h;次日取出混合物6000r/min離心20min，棄上清，沉淀用0.5mL生理鹽水溶解備用;若需長期保存可加入等體積甘油，-20℃保存備用。整個操作步驟注意避光。

1.2.5 改良過碘酸鈉法的優化 乙二醇還原步驟的優化:NaIO4氧化后加入乙二醇，再用醋酸鈉緩沖液透析;NaIO4氧化并醋酸鈉緩沖液透析后，乙二醇還原。

NaIO4氧化濃度的優化:5mg HRP中分別加入21mg/mL 的 NaIO40.2、0.3、0.4、0.5mL。

NaIO4氧化時間的優化:0℃冰浴搖動15、30、45、60min。

乙二醇還原量的優化:5mg HRP分別需要0.16mol/L 乙二醇 0.3、0.5、0.7、0.9mL。

酶、抗體最佳結合比例的優化:酶∶抗體質量比分別為 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。

NaBH4封閉量的優化:5mg HRP中分別加入5mg/mL NaBH40.1、0.3、0.4、0.5mL。

1.2.6 酶標抗體(HRP-山羊抗兔IgG)質量的鑒定按照以下公式計算酶量、IgG量、克分子比、酶結合率(僅針對改良過碘酸鈉法制備的酶標抗體)。

酶量(mg/mL)=OD403×0.4;IgG量(mg/mL)=克分子比=酶量×4/IgG量;酶結合率(%)=酶量/5mg×100(OD403是酶中鐵葉琳輔基的吸光度，OD280是抗體-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度)。

1.2.7 試劑盒封閉液的優化 TAS-ELISA檢測中的封閉步驟至關重要，如果封閉不好很可能導致本底過高。本研究采用6種不同的封閉液進行封閉實驗(5%BSA、10%BSA、5%BSA+5% 蔗糖、10%BSA+5%蔗糖、3%明膠、5%明膠)，以期達到最優的封閉效果。

表1 兩種自制酶標抗體不同稀釋度檢測結果比較Table 1 The comparison on two kinds of self-enzyme conjugates from different dilutions

1.2.8 試劑盒靈敏度測定 LM單克隆抗體包被酶聯板(1μg/mL)4℃過夜;PBST洗滌后封閉液37℃封閉1h;PBST洗滌;加入樣品，37℃ 2h;洗滌后加入LM多克隆抗體(1μg/mL)37℃ 1.5h;洗滌并加入自制酶標抗體，37℃1.5h;PBST洗滌，TMB顯色 5～10min(AP底物為PNP)，2mol/L濃硫酸終止反應，測OD450(AP測OD405)，判斷原則:陰性對照OD＜0.1且陽性對照OD/陰性對照OD＞2.0表明實驗成功、實驗結果可靠;樣品OD/陰性OD﹥2.0為陽性、樣品OD/陰性OD﹤2.0為陰性。

1.2.9 試劑盒特異性實驗、干擾實驗 特異性實驗:TAS-ELISA試劑盒檢測LM等20株致病菌，來驗證試劑盒檢測LM的特異性，觀察是否有交叉反應、是否有假陽性出現。

干擾實驗:將LM與其他致病菌1∶1等量混合后取100μL為樣品加入酶聯孔中，觀察其它致病菌是否對TAS-ELISA檢測LM有非特異性干擾、是否有假陰性出現。

1.2.10 試劑盒重復性和穩定性測定 試劑盒板內重復性實驗:在同一包被板上，以109cfu/mL的純菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉為樣品(每個樣品5個反應孔，同時設置陰性對照)，利用自制的TAS-ELISA試劑盒進行檢測，計算每個樣品OD450的平均值與標準偏差，進而計算每個樣品的板內變異系數(以上實驗重復5次)。

試劑盒板間重復性實驗:取5個包被板，以109cfu/mL的純菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉為樣品(每個樣品在每個包被板上設置1個反應孔，同時設置陰性對照)，進行TAS-ELISA檢測，計算每個樣品OD450的平均值與標準偏差，進而計算每個樣品的板間變異系數(以上實驗重復5次)。

1.2.11 試劑盒保存期實驗 將制備好的酶標抗體、底物溶液、試劑盒(包括已包被抗體的酶聯板、各種緩沖液、抗體、底物溶液)置于4℃冰箱保存，并于0、30、60、90d對其進行 TAS-ELISA檢測。

2 結果與討論

2.1 山羊抗兔IgG濃度的測定

BCA濃度測定試劑盒檢測結果:山羊抗兔IgG平均濃度為104.58mg/mL(圖1)。

2.2 兩種自制酶標抗體檢測結果

圖1 山羊抗兔IgG抗體濃度測定結果Fig.1 The concentration of goat anti-rabbit IgG

表1結果顯示:AP-山羊抗兔IgG僅在稀釋10倍時有微弱的顏色反應，且成本較高(500U AP僅能制備酶標抗體20μL);而自制HRP-山羊抗兔IgG在稀釋1500倍時仍有較強的顏色反應，說明HRP-山羊抗兔IgG效果優于AP-山羊抗兔IgG。分析其原因主要如下:戊二醛法僅有2%～10%的酶與40%的抗體蛋白結合，而且結合物有效部分只占5%，酶和抗體的利用率低;過碘酸鈉改良法在低pH條件下直接氧化HRP，可以使70%～90%的酶與99%的抗體蛋白結合，交聯效果好、酶失活小，且酶活性不受影響。有文獻表明HRP可提高檢測靈敏度［12-13］，且改良法HRP自身交聯率僅為5%，標記效果優于戊二醛法、經典過碘酸鈉氧化法、戊二醛-過碘酸鈉氧化法［11，14］。

2.3 改良過碘酸鈉法優化實驗酶標抗體質量的鑒定

改良過碘酸鈉法優化實驗結果表明(表2)，氧化5mg HRP用0.2mL 21mg/mL NaIO4效果最好，此時酶溶液會立即呈現灰綠色，這是由于酶分子中含有鐵葉啉，故氧化過程中顏色的改變也是證明HRP有無徹底氧化的最佳證據。NaIO4氧化時間在15min已能滿足要求，時間過短則不能徹底氧化，過長則會降低酶活力，導致結合物效價降低。有些文獻在HRP的標記過程中沒有乙二醇還原的步驟，本實驗證明加入乙二醇是極其必要的，因為NaIO4可以在很短的時間內將乙二醇氧化成乙二醛，這樣可以阻止NaIO4對酶的繼續氧化，有效避免了氧化過度造成的酶活力下降。加入乙二醇后原來的灰綠色溶液逐漸恢復了原來的橙色，實驗證明0.3mL 0.16mol/L乙二醇已經足以阻止氧化劑對酶的過度氧化。酶與抗體結合的質量比是整個實驗的關鍵步驟，實驗表明“酶∶抗體質量比=1∶2”時能夠達到最大的結合效率，2∶1、1∶1、1∶3 時效果都不好，這與其他研究者的結果一致［15］;用飽和硫酸銨沉淀時，酶結合物(橙色)在沉淀部分，“酶∶抗體質量比=2∶1”實驗組上清出現橙色，說明酶過量，即上清中存在未結合的酶;1∶1、1∶2、1∶3實驗組上清接近無色，表明酶與抗體幾乎完全結合;少量未結合的酶可以通過離心或洗滌的方法除去，不會影響最終的顯色;但是如果抗體量過多，那么未標記的抗體會與酶標抗體競爭結合抗原，減少了結合到固相上的酶標抗體的量，所以絕不能使抗體的量遠大于酶的量。5mg HRP中加入5mg/mL NaBH40.1mL，此時未見明顯氣泡產生;而加入0.3、0.4、0.5mL時，管壁產生大量氣泡。資料顯示，酶標抗體克分子比為0.7則標記效果一般，為1.0效果較好，大于1.5效果滿意;酶結合率7%效果一般，9%～10%效果較好，高于25%為滿意。本實驗室根據上述優化結果制備的酶標抗體克分子比最高可達2.9，酶結合率達27%，標記效果較為滿意。

表2 酶標記抗體(HRP-山羊抗兔IgG)質量的鑒定Table 2 The identification of HRP-IgG

表3 自制酶標抗體、商業化酶標抗體TAS-ELISA試劑盒檢測靈敏度Table 3 The sensitivity of self-made enzyme conjugates and commercial enzyme conjugates

2.4 試劑盒最優封閉液的確定

圖2中10%BSA、10%BSA+10%蔗糖、3%明膠、5%明膠封閉效果不好，可能是封閉不當造成的陰性本底過高;與“5%BSA”相比，“5%BSA+10%蔗糖”效果更好，這可能是由于蔗糖起到了固化劑的作用，使BSA封閉效果更佳。

2.5 試劑盒靈敏度實驗結果

表3結果顯示:自制酶標抗體、商業化酶標抗體TAS-ELISA試劑盒在純菌液、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉中的檢測靈敏度一致，依次是106、107、107、106、108、109cfu/mL;在牛奶中兩種方法的檢測靈敏度分別為 107、109cfu/mL。

2.6 試劑盒特異性實驗、干擾實驗結果

自制TAS-ELISA試劑盒特異性實驗結果顯示(表4):LM的檢測結果呈陽性，其他18株致病OD450均低于0.1，無假陽性出現，表明該方法檢測LM特異性好。干擾實驗結果顯示:金黃色葡萄球菌等18株常見致病菌對該法沒有干擾，即使有一半其他雜菌的存在，該方法也可特異性檢出LM，不會有假陰性的出現。

表4 自制TAS-ELISA試劑盒特異性實驗、干擾實驗結果Table 4 The result of specific experiment and interference experiment by Self-TAS-ELISA KIT

表5 試劑盒板內重復性實驗結果Table 5 The repeatable result in the same 96-well plate

圖2 6種不同封閉液的檢測結果Fig.2 The test result of six different blocking solution

2.7 試劑盒的重復性、穩定性

表5、表6重復性實驗表明:自制酶標抗體TASELISA試劑盒板內變異系數在0.89%～2.99%之間，板間變異系數在0.93%～4.74%之間。一般ELISA要求板內變異系數低于5%、板間變異系數低于10%［16］，本試劑盒均符合以上要求，說明該試劑盒重復性好、準確度高。

HRP常用的底物有鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、2，2＇-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)等。本研究采用TMB作底物的主要原因是:TMB經酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明，加酸停止酶反應后變黃色，可在比色計中定量，無致癌作用;且張喜悅等［17］的研究證明，TMB較OPD、TMB、ABTS而言，更適合做 ELISA實驗的底物。

2.8 試劑盒的保存期

圖3顯示:自制酶標抗體、TMB底物溶液、試劑盒0～90d檢測結果OD值基本保持一致、無顯著差異，表明其在4℃冰箱至少可以保存90d，說明該試劑盒具有較好的穩定性。

2.9 試劑盒的檢測成本、檢測周期

試劑盒成本:Abcam公司LM單克隆抗體(4000元、2500孔)成本1.6元/孔;Abcam公司LM單克隆抗體(4000元、4000孔)成本1.0元/孔;Solarbio公司山羊抗兔IgG抗體價格較低，小于0.5元/孔;因此自制TAS-ELISA試劑盒成本小于3.5元/孔。

檢測周期:檢測時直接在已經包被LM單克隆抗體的酶聯板中加入樣品，孵育2h;封閉1h;洗滌后加入LM多克隆抗體，孵育1.5h;加入自制酶標抗體，37℃1.5h;TMB顯色5～10min后濃硫酸終止反應，整個檢測周期少于6h。

表6 試劑盒板間重復性實驗結果Table 6 The repeatable result in the different 96-well plate

圖3 試劑盒保存期實驗Fig.3 The result of validity by Self-TAS-ELISA KIT

3 結論

TAS-ELISA是一種以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種敏感性很高的實驗技術。本研究制備的酶標抗體克分子為2.9，酶結合率達27%，標記效果滿意;自制酶標抗體TAS-ELISA試劑盒檢測限與商業化酶標抗體TAS-ELISA試劑盒相同，特異性實驗、干擾實驗表明常見食源性致病菌對該法沒有抑制和干擾，同時試劑盒具有較好的穩定性(板內變異系數最高為2.99%、板間變異系數最高為4.74%)，檢測成本為3.5元/孔，使用包被好抗體的酶聯板，檢測周期僅需6h。TAS-ELISA試劑盒不需提取DNA、不需增菌、可同時檢測大量樣品，大大節省了檢測時間，是一種靈敏、特異、快速、高通量、低成本的檢測技術。另外，TAS-ELISA較DAS-ELISA成本低、特異性好，提高了實驗的可靠性與準確度，完全適合日常檢測，有較高的使用價值和應用前景。

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Comparison of two methods in preparation of enzyme conjugates and optimization of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT

LIU Ya-li1，2，3，LIU Fang4，LIU Qing3，*，HAN Shun-yu2，SUN Zhi-bo5，XIA Jun-fang2，ZHU Xiao-qing6
(1.The Second Affiliated Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China;2.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;3.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;4.Internation Travel Healthcare Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China;5.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;6.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China)

TS207.3

A

1002-0306(2012)15-0301-07

2011-12-26 *通訊聯系人

劉雅莉(1984-)，女，碩士，研究方向:食源性致病菌的快速檢測。

質檢總局科研項目(GSCIQ_2010IK220)。