高效液相色譜法測定番茄及其制品中番茄甙的含量

張 玉，吳慧明，王 偉，徐麗紅，王建清

(1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江杭州310021;2.浙江大學農藥與環境毒理研究所，浙江杭州310029)

高效液相色譜法測定番茄及其制品中番茄甙的含量

張 玉1，吳慧明2，王 偉1，徐麗紅1，王建清1

(1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江杭州310021;2.浙江大學農藥與環境毒理研究所，浙江杭州310029)

建立了固相萃取-高效液相色譜(HPLC)測定番茄及番茄制品中番茄甙的方法。樣品中的番茄甙經過甲醇提取，PCX固相萃取法凈化，乙酰化后，采用高效液相色譜法進行測定。以乙腈和水(90∶10)為流動相，經過C18色譜柱分離，紫外檢測器檢測。結果表明:番茄甙的檢出限為 0.5mg/kg，方法回收率為90.5%～93.5%，相對標準差為1.7%～3.2%。該方法準確、靈敏、適用于番茄及番茄制品中番茄甙的測定。

番茄甙，測定，HPLC

Abstract:A method was developed for determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography(HPLC).The tomatine in sample was extracted by methanol，cleaned up with PCX solid-phase extraction cartridge，then acetylated by acetic anhydride and determined by HPLC.The mobile phase consisted of 90%acetonitrile and 10%water.The tomatine was separated on C18column and determined with UV detector at 205nm.The results showed:the detection limit of tomatine was 0.5mg/kg，the average recoveries were from 90.5%to 93.5%，and the relative standard deviations(RSDs)was from 1.7%to 3.2%.This method was accurate，sensitive and effective for determination of tomatine in tomato and its processed products.

Key words:tomatine;determination;HPLC

番茄甙又名番茄素、番茄堿，是存在于番茄葉和果實中的次生代謝產物，是一種含有D-木糖、D-半乳糖及兩分子葡萄糖的甾體類糖苷生物堿，具有抗菌和驅蟲的作用，其含量隨著番茄成熟而降低［1］。番茄甙高濃度下具有一定的毒性［1］，因此美國規定新選育的番茄品種必須檢測番茄甙的含量。但也有研究發現，一定含量的番茄甙具有降低膽固醇含量，提高免疫力，抗菌等生物活性［1-4］，鑒于其毒性及生物活性，測定番茄及其制品中番茄甙的含量就尤為重要。目前國內外的測定方法有分光光度法［5］，高效液相色譜法(HPLC)［6-8］、氣相色譜-質譜聯用法［9］等。但分光光度法易受樣品中的雜質干擾，而使測定結果不準;氣相色譜-質譜聯用法需將糖苷水解才能測定，不能直接定量;而高效液相色譜法相對比較簡單、準確，但由于番茄甙的紫外吸收較低，用紫外檢測器檢測靈敏度不高，且易受雜質干擾。因此本研究通過固相萃取純化樣品，提高番茄甙與樣品中雜質的分離度，并用柱前衍生法改變番茄甙的紫外吸收能力，提高方法的檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈 色譜純，德國默克;氨水 分析純，杭州高晶精細化工有限公司;乙酸酐 分析純，上海凌峰化學試劑有限公司;吡啶 分析純，上海精析化工科技有限公司;番茄甙標準品(tomatine) 純度大于98%。

Dionex Ultimate-3000高效液相色譜儀 帶紫外檢測器;分析天平 Startarius，BS223s;KQ-50B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RV10旋轉蒸發儀 IKA;TDL-5-A離心機 ANKE;QGC-12T氮吹儀 上海泉島;HLB固相萃取柱(200mg，3mL)Waters;PCX陽離子交換固相萃取柱(150mg，6mL)、C18固相萃取柱(500mg，6mL)Agela。

1.2 樣品制備

將樣品用四分法取樣或直接放入組織搗碎機中搗碎混勻，制成待測樣，放入分裝容器中于-18℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

稱取試樣5.00g，放入具塞刻度離心管中，用甲醇定容至20mL，劇烈振蕩1min后，超聲提取15min，離心，取上清液10mL，再加10mL水混勻后，上預先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的PCX陽離子交換固相萃取柱，待樣液完全過柱，用3mL 40%的甲醇水溶液清洗柱子，最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脫，洗脫液收集于10mL具塞試管中，在50℃下氮氣吹干。

1.4 樣品衍生化

向試管中加0.2mL吡啶，0.4mL乙酸酐，漩渦1min，蓋上塞子，沸水浴50min，取出放入水中冷卻后，加10mL 40%的甲醇溶解，溶解液上預先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的C18固相萃取柱，待溶解液完全過柱后，用40%的甲醇5mL清洗萃取柱。而后用5mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50℃下氮吹干，加1mL甲醇溶解，過0.45μm有機濾膜后待測。

1.5 液相色譜參考條件

色譜柱:waters symetry C18柱，4.6mm ×250mm(5μm);流動相:乙腈∶水(V/V)=90∶10;流速:1.0mL/min;檢測波長:205nm;柱溫:30℃;進樣量:20μL。

1.6 標準曲線繪制

稱取一定量的番茄甙，用甲醇配制成質量濃度為1g/L的標準貯備液。吸取適量標準貯備液，用甲醇稀釋成100mg/L的標準中間工作液。取標準中間工作液 0.0、0.025、0.050、0.100、0.25、0.50、1.00mL，氮氣吹干。進行衍生后，測定。即濃度為0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0mg/L，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

對不同溶劑，即甲醇、乙醇、甲醇∶氯仿(50∶50)提取效果進行比較。經比較發現甲醇對番茄甙的提取效率最高(表1)，因此選取甲醇作為提取劑。

表1 不同提取溶劑對回收率的影響Table 1 Effect of different extraction solutions on recovery

2.2 試樣凈化方法選擇

由于樣品中含有較多雜質，影響樣品的分離度，因此選取C18、HLB和PCX 3種固相萃取柱進行前處理凈化，實驗采用標準溶液過柱，然后對3種固相萃取柱的回收率進行比較。表2結果表明PCX固相萃取柱的回收率最好，為96.5%。其他兩種固相萃取柱的回收率偏低分別60.5%和45.2%，不適用作為凈化方法。隨后，對經PCX固相萃取柱凈化后的樣品進行色譜分析，結果表明經PCX固相萃取柱凈化后，能夠去除樣品中雜質干擾，得到較好的凈化效果(圖3～圖4)。

表2 不同固相萃取柱對回收率的影響Table 2 Effect of different solid-phase extraction cartridges on recovery

2.3 番茄甙衍生條件選擇

番茄甙的紫外吸收較弱，直接用紫外檢測器測定，靈敏度低。由于番茄甙的糖苷上的羥基，在吡啶存在下，能與乙酸酐發生乙酰化反應，增加雙鍵，增強紫外吸收，因此實驗通過對番茄甙進行乙酰化后再測定。為保證衍生充分，采用乙酰化常用的吡啶/乙酸酐(1∶2)作為衍生化試劑，并在前期預備實驗中分別加入0.4、0.8、1.2mL乙酸酐進行衍生，結果表明3種體積的乙酸酐對產物含量影響不大，即0.4mL乙酸酐已經過量。因此在接下來的實驗中均采用0.4mL乙酸酐進行。

為選擇最佳衍生時間，對標準物質分別衍生化20、30、40、50、60、70min 后，測定產物的峰面積。圖 1表明，隨著時間增長，產物峰面積變大，但到50min時基本穩定，而后略有下降，因此選取50min作為最佳衍生時間。

圖1 乙酰化時間對產物峰面積的影響Fig.1 Effect of derivation time on the chromatogram peak area of production

2.4 紫外吸收波長的確立

通過對溶解于甲醇中的番茄甙衍生物紫外吸收掃描，發現在205nm處有最大吸收。因此選擇檢測波長在205nm處，可確保方法的檢測靈敏度。并通過DAD進行光譜輔助定性(圖2)。

圖2 番茄甙衍生物的光譜圖Fig.2 The spectrogram of tomatine derivation product

2.5 儀器條件的選擇

選擇乙腈和水作為流動相進行樣品測定。結果表明樣品在乙腈∶水(90∶10)的情況下，番茄甙衍生物與其他雜質能夠得到很好的分離(圖3～圖4)。

圖3 標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of tomatine standard

圖4 番茄樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of tomato sample

2.6 線性范圍與檢出限

在0～100mg/L之間，紫外吸收峰面積與番茄甙的濃度具有較好的線性關系，相關系數R2=0.9999(圖5)。以3倍信噪比的方法得出，本方法檢出限為0.5mg/kg。

圖5 番茄甙標準曲線圖Fig.5 Standard curve of tomatine

2.7 準確度和精密度

以添加回收率表示方法的準確度，相對標準差(RSD)表示方法的精密度。在不同樣品中加入不同水平已知量的標準物質，同時測定樣品和加標樣品，計算回收率。從表3結果分析，不同添加水平的樣品回收率在90.5%～93.5%之間，方法的相對標準差在1.7%～3.2%之間。滿足樣品檢測的要求。

表3 方法回收率和相對標準差(%)Table 3 The recoveries and relative standard deviations of the method

2.8 樣品測定結果

采用本實驗所建立的方法對不同番茄及番茄制品進行測定，該方法適用于番茄及其制品的測定。對不同成熟度的番茄測定結果表明，隨著番茄成熟度增加，番茄甙含量減少;番茄醬樣品則未檢出番茄甙(表4)。

表4 番茄及番茄醬中番茄甙的含量Table 4 The contents of tomatine in different tomatos and tomato jam

3 結論

綜上所述，本實驗建立了固相萃取-柱前衍生-高效液相色譜法測定番茄及番茄制品中番茄甙的測定方法。該方法的回收率為90.5%～93.5%，相對標準差為1.7%～3.2%，檢出限為0.5mg/kg。該方法具有儀器要求不高，準確度和靈敏度高的特點，適用于番茄及番茄制品中番茄甙的測定。

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Determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography

ZHANG Yu1，WU Hui-ming2，WANG Wei1，XU Li-hong1，WANG Jian-qing1
(1.Institute of Quality and Standard for Agriculture Product，Zhejiang Academy of Agriculture Science，Hangzhou 310021，China;2.Institute of Pesticide and Environmental Toxicology，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

TS255.1

A

1002-0306(2012)15-0322-03

2011-12-15

張玉(1977-)，女，博士，副研究員，研究方向:食品安全檢測。

浙江省科技廳重大科技專項(2009C12052)。