金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子在子宮內膜異位癥的表達

張紅娟，何康玲，王 莉

金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子在子宮內膜異位癥的表達

張紅娟，何康玲，王 莉

子宮內膜異位癥（EM）；基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）；腫瘤壞死因子（TNF）

具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位時稱為子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）。EM是一種具有惡性侵襲行為的良性婦科疾病，主要的臨床表現為痛經、盆腔包塊和不孕等，近年發病率不斷上升，嚴重影響婦女的生殖健康及生活質量。其發生機制至今尚不清楚，故引起研究者的廣泛關注，并成為當今一個研究熱點。已有大量研究報道，免疫系統的變化，包括各種免疫球蛋白、細胞因子（CK）、整合素家族等均參與了EM的發病過程，并起著關鍵作用。腫瘤壞死因子（TNF）能夠促進血管內皮生成因子 （VEGF）的生成，基質金屬蛋白酶9（MMP-3）能降解細胞外基質ECM（extra cellular matrix，ECM）。本研究通過測定EM患者血清中的MMP-9、TNF及異位和在位內膜中MMP-9的表達，探討TNF與MMP-9在EM發病機制中的相關性，為治療EM提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009-01～2011-10因EM在筆者所在醫院婦產科行腹腔鏡手術的患者32例作為試驗組，年齡21～45歲，平均37.18歲；均取在位內膜和異位內膜灶，分為在位內膜組與異位內膜組。選取同期因子宮肌瘤切除子宮或單純肌瘤剔除患者的子宮內膜32例作為對照組，年齡27～49歲，平均40.31歲。所取標本經中性甲醛液固定后石蠟包埋，待用。同時抽取試驗組和對照組患者術前清晨空腹靜脈血5 ml，自然凝固，臺式離心儀2500 r/min，5 min分離血清，貯存于-80℃冰箱中，待測。研究對象術前3個月內均未用激素治療，術后組織病理學檢查證實為EM和子宮平滑肌瘤。

1.2 方法 取異位內膜組在位子宮內膜和異位內膜標本，以及對照組的子宮內膜，放入多聚甲醛（10%PF）固定液于4℃冰箱中固定24～48 h。組織經過沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片后烤干備用（光鏡和免疫組織化學）。每個標本取1張切片用HE染色，進行組織結構的觀察。所有標本經10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4 μm連續切片備用，采用免疫組化SABC法檢測篩選標本中MMP-9，一抗及SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，一抗為鼠抗人MMP-9單克隆抗體，主要操作步驟如下：用3%H2O2封閉內源性過氧化酶20 min；于98℃下微波修復抗原，4℃孵育過夜后，加正常羊血清封閉20 min；滴加一抗MMP-9抗體稀釋后的質量濃度分別為1∶100和1∶100滴加二抗；室溫放置10 min，滴加試劑SABC；10 min后DAB染色5 min；蘇木素復染。血清中MMP-9、TN含量的測定采用ELISA法，嚴格按試劑盒說明的實驗步驟檢測。

1.3 結果判定 光學顯微鏡下觀察組織切片細胞胞漿、基質的顯色反應，MMP-9陽性信號均呈棕黃色或棕褐色。利用全自動病理圖像分析儀及圖像分析軟件對切片進行分析，每張切片隨機選取5個視野，以平均光密度 （mean optical density，MOD，MOD=有效測量面積范圍內目標染色區累積光密度值/有效測量區域面積）表示MMP-9表達強度，每次閱片前校正光密度，閱片時保持每張切片光線、白平衡等參數不變。

2 結 果

2.1 兩組患者血清中MMP-9、TNF含量 試驗組患者血清中MMP-9、TNF含量明顯高于對照組（P<0.01），見表1。

表1 試驗組和對照組患者血清中MMP-3、TNF的含量

表1 試驗組和對照組患者血清中MMP-3、TNF的含量

與對照組比較，*P<0.01

MMP-3（ng/ml） TNF（pg/ml）34.472±5.447*19.629±5.493*2.977±1.201 12.527±3.529分組 n試驗組 32對照組 32

2.2 MMP-9在不同內膜組織中的表達 在各組子宮內膜組織中，MMP-9陽性信號主要位于組織的腺體上皮細胞，部分位于間質中。MMP-9在異位和在位內膜組中的表達均無顯著性差異（P＞0.05），但均高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 MMP-9在各組子宮內膜中的表達（MOD，

表2 MMP-9在各組子宮內膜中的表達（MOD，

與在位內膜組比較，*P＞0.05，與異位和在位內膜組比較，#P＜0.05

MMP-9 0.32±0.09 0.34±0.09*0.26±0.04#分組 n試驗組在位內膜組 32異位內膜組 32對照組 32

3 討 論

基質金屬蛋白酶（MMPs）是鋅依賴性的蛋白酶家族，是惡性腫瘤發生轉移與浸潤的一種重要介質。目前已證明EM患者子宮的在位和異位內膜均可分泌MMPs，并在EM的發病過程中具有重要作用。MMPs可以降解ECM和基底膜的所有成分，依其降解底物的不同可分為6型約19種。MMP-9是MMPs家族中相對分子質量最大的明膠酶，能降解ECMⅣ、Ⅴ型膠原和明膠等主要成分，并能促進血管內皮細胞生長，導致新生血管的形成，同時可通過與整合素的相互活化而加強細胞間的粘附作用，從而在子宮內膜細胞的異位粘附、種植、生長的過程發揮重要作用[1]。本文結果顯示，MMP-9在異位和在位內膜組織中的表達顯著高于對照組，說明異位和在位內膜組織中MMP-9的過度表達可能使異位和在位內膜具有很強的侵襲種植能力。

TNF是一類具有多種生物活性的細胞因子，是由激活的單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等產生的高效能的細胞因子，一方面是機體免疫保護的重要介質，另一方面可參與機體的免疫病理損傷[1]。本文結果表明，EM患者血清中的TNF的含量明顯高于正常對照組，可能系腹腔液內存在大量的TNF入血所致，也可能與EM患者外周血單核細胞活性增強，免疫防御功能受到破壞，導致機體的細胞因子調節系統紊亂，過量的TNF不僅可以抑制IgG和IgM的產生，而且還影響某些克隆T細胞的分化，使T淋巴細胞不能發揮正常的免疫反應所致[2]。TNF-α通過介導炎癥和免疫反應，使多種細胞產生多種細胞因子，促進子宮內膜間質細胞生長和分泌VEGF（血管內皮生成因子）。TNF可能誘導腹腔間皮細胞表達黏附分子，使內膜基質細胞粘附在腹腔間皮細胞，同時TNF通過促進子宮內膜間質細胞生長和分泌VEGF，使異位內膜基底部毛細血管的數量和面積增多，有利于內膜的種植、生長，向組織深部浸潤。

研究認為TNF、血管內皮生長因子等細胞因子又可促進MMP的合成，從而在細胞粘附、種植、新生血管的形成、組織纖維化和機體免疫機制中起到非常重要的作用[3-7]。正是由于多種細胞因子與肥大細胞的相互作用、相互影響形成網絡結構，共同促進了EM的形成和發展。本文結果也顯示，EM患者血清中的MMP-9和TNF同時升高，一方面TNF通過自身炎性細胞因子的作用加速EM的發生發展，誘導腹腔間皮細胞表達粘附分子，使內膜基質細胞粘附在腹腔間皮細胞，促進內膜間質細胞的生長和VEGF的分泌；另一方面，通過誘導MMP-9的分泌，增強異位內膜對ECM水解破壞和促進異位灶新生血管的形成，協同促進了EM的發生發展。

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[2012-02-27收稿，2012-03-20修回]

[本文編輯：宋 敏]

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R711.71

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450007河南鄭州，153醫院婦產科（張紅娟，何康玲，王莉）