大孔吸附樹脂純化乳苣多酚的研究

周向軍，高義霞，張慧芳，張 繼，2，*

(1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001;2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070)

大孔吸附樹脂純化乳苣多酚的研究

周向軍1，高義霞1，張慧芳1，張 繼1，2，*

(1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001;2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070)

通過吸附和解吸附實驗篩選適合乳苣多酚純化的大孔吸附樹脂并確定其最佳工藝。結果表明:D-101為乳苣多酚純化的最佳樹脂，在150min內達到吸附平衡，120min內解吸附平衡。最佳上樣濃度為0.2mg·mL-1，pH4，解吸劑濃度為60%乙醇，洗脫速率為0.5mL·min-1，洗脫體積為3BV。紫外吸收表明純化后乳苣多酚純度得到提高。結果說明，D-101可用于乳苣多酚進一步純化。

乳苣，多酚，純化，大孔吸附樹脂

Abstract:According to adsorption and desorption performance towards polyphenol，an optimal macroporous resin was selected from D-101，NKA-9 and AB-8 resins to purify crude polyphenol extracted from Mulgedium tataricum L.The results showed that D-101 was the optimal resin and consequently，was chosen.The optimal adsorption and desorption conditions of Mulgedium tataricum L.polyphenol were determined as follows:The adsorption equilibrium time was 150min and desorption 120min.Polyphenol concentration of sample was 0.2mg·mL-1，pH4，the optimal desorbent concentration，flow rate and elution volume for the desorption of Mulgedium tataricum L.polyphenol were 60%ethanol，0.5mL·min-1and 3BV.Ultraviolet absorption showed that Mulgedium tataricum L.polyphenol purity was improved after column adsorption，which indicated D-101 could be furtherly used to purify Mulgedium tataricum L.polyphenol.

Key words:Mulgedium tataricum L.;polyphenol;purification;macroporousresin

植物多酚(plant polyphenol)是一類多羥基化合物，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素，主要存在于植物的葉、果等部位［1］。植物多酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、降血壓、降血糖、抗輻射、抗動脈硬化、防冠心病等一系列藥理作用［2-3］，但目前大多數研究集中在茶多酚、蘋果多酚和葡萄多酚等方面［4-5］。乳苣(Mulgedium tataricum L.)，又稱蒙山萵苣、紫花山萵苣、苦菜，為菊科乳苣屬多年生草本植物，廣泛分布于歐洲及我國內蒙古及西北地區［6］。本課題組前期研究表明乳苣富含多酚類物質，高達36%［7］，但關于大孔吸附樹脂純化乳苣多酚的工藝未見報道。大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機溶劑的新型非離子型高分子聚合物，由于其具有物化穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性強、吸附速度快、成本低和吸附解析條件溫和等一系列優點，因而在天然活性物質，尤其是黃酮、皂苷和生物堿等水溶性化合物的分離純化方面具有一定的優勢［8-9］。本課題組在前期研究的基礎上［7］以乳苣為材料，比較幾種大孔吸附樹脂對乳苣多酚的吸附性能，篩選出合適的樹脂，并確定最佳的吸附和解吸附條件，對乳苣多酚的純化效果進行比較，旨在探討大孔吸附樹脂吸附工藝，確定可靠的工藝參數，為進一步開發利用乳苣資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳苣 采自甘肅靖遠縣水田邊，經天水師范學院汪之波副教授鑒定為菊科乳苣屬，50℃殺青粉碎過80目篩備用;Folin-Ciocaileu(Folin試劑) 試劑配制按王岸娜的方法稍作修改［10］︰在1L磨口回流裝置內加入50g鎢酸鈉，12.5g鉬酸鈉，350mL蒸餾水，25mL 85%濃磷酸及50mL 37%濃鹽酸，充分混勻以小火回流10h，加入75g硫酸鋰，25mL蒸餾水，30mL H2O2，開口繼續加熱至沸，維持15min，驅除多余的溴，溶液呈金黃色，冷卻后補足蒸餾水至500mL，置于冰箱中長期冷藏備用，臨用時稀釋1倍;NKA-9，AB-8，D-101三種大孔吸附樹脂 天津南開大學化工廠;其余試劑均為分析純。

722型分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;UV1800型紫外分光光度計 日本島津;電子天平德國梅特勒-托利多;旋轉蒸發儀 上海亞榮。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳苣多酚粗提液的制備 在前期實驗的基礎上進行［7］。在提取時間40min，浸提溫度35℃，液固比1∶25，乙醇濃度55%條件下進行乳苣多酚提取，3000r·min-1離心10min，保留上清液，濾渣進行第二次抽提，合并兩次上清液，旋轉蒸發濃縮并定容，得多酚粗提液。

1.2.2 標準曲線的制作及乳苣多酚含量的測定 按張汆的方法稍作修改［11］。精密稱取沒食子酸標準品0.05g，溶解并定容至100mL，得0.5mg·mL-1的標準溶液。準確吸取 0、1、2、3、4、5、6mL 標準溶液，置于50mL容量瓶中，蒸餾水定容。分別從上述不同濃度的標準溶液中移取5mL置50mL容量瓶中，各加入25mL蒸餾水，4mL Folin-試劑，搖勻，靜置4～5min后各加入8mL 10%Na2CO3溶液，蒸餾水定容，置于75℃恒溫水浴鍋中10min，顯色后于765nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，沒食子酸質量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線。取一定體積乳苣多酚液，同標準曲線操作，計算樣液多酚含量，使用前稀釋成一定濃度。

多酚含量(mg)=樣液多酚含量(mg)/樣液體積(mL)×提取液總體積(mL)×10

1.2.3 大孔吸附樹脂的預處理 AB-8、NKA-9、D-101大孔吸附樹脂用95%乙醇室溫下密封浸泡24h，使之充分溶脹，用蒸餾水反復沖洗至無白色渾濁，然后加入4%氫氧化鈉溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性，再用4%的鹽酸溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性，濾出樹脂備用［12］。

1.2.4 靜態吸附解吸實驗 準確稱取用濾紙吸干的AB-8、NKA-9、D-101 樹脂各0.5g，置于100mL 錐形瓶中，加入50mL 0.5mg·mL-1的乳苣多酚液，避光密封，在28℃恒溫恒速振蕩器中振蕩(120r·min-1)吸附6h，每隔1h取1mL吸附液測其多酚含量;靜態吸附后，過濾除去乳苣多酚溶液，用蒸餾水洗凈濾干，樹脂置于100mL錐形瓶中，加入50mL 95%乙醇，避光密封，在28℃恒溫恒速振蕩器中振蕩(120r·min-1)解吸6h，每隔1h取1mL解吸液測其多酚含量，考察乳苣多酚不同樹脂的靜態吸附解吸曲線［13］。

吸附率A(%)=(C0-C1)/C0×100

式中 C0，C1-吸附前后樣液多酚濃度，mg·mL-1;

解吸率D(%)=(C＇1×V1)/(C＇0×V0×A)×100

式中:A為吸附率;C＇1-解吸后溶液濃度，mg·mL-1;V1-解吸液體積;V0-洗脫液體積，mL;C＇0-吸附液起始濃度，mg·mL-1。

1.2.5 動態吸附解吸附實驗

1.2.5.1 吸附實驗 a.不同樣液濃度對吸附率的影響:準確稱取經預處理的一定質量的D-101樹脂轉入250mL具塞錐形瓶，分別加入不同體積的乳苣多酚樣液，使其終濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg·mL-1，28℃振蕩(120r·min-1)吸附，測定溶液多酚濃度，計算吸附率。b.不同pH對吸附率的影響:在上述確定的乳苣多酚濃度下，分別加入pH為2、3、4、5、6、7的多酚樣液，操作同上，測定溶液多酚濃度，計算吸附率。

1.2.5.2 解吸實驗 a.不同洗脫劑的選擇:以60%的甲醇、乙醇、丙酮和蒸餾水為洗脫劑，加入到含飽和吸附樹脂的錐形瓶中，28℃振蕩解吸附(120r·min-1)，測定解吸率，考察不同洗脫劑對洗脫效果的影響。b.最佳洗脫劑濃度的選擇:以40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為洗脫劑對已吸附飽和的D-101樹脂進行解吸附，測定解吸液的多酚濃度，計算解吸率，考察最佳洗脫劑濃度。c.不同洗脫速度對乳苣多酚解吸的影響:取經過預處理的D-101樹脂裝入玻璃層析柱中(1×30cm)。在最佳吸附濃度和pH條件下上柱，考察流速分別為0.5、1、2、3mL·min-1時乳苣多酚樣液的多酚含量，確定最佳流速。d.以多酚含量為縱坐標，洗脫體積為橫坐標，繪制洗脫體積曲線。

1.2.6 純化前后乳苣多酚波長掃描比較 純化前后乳苣多酚在250～450nm范圍內進行波長掃描，以考察乳苣多酚純化情況。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

以沒食子酸為標準品，多酚測定標準曲線回歸方程為Y=2.9579X-0.01，R2=9991，線性良好，見圖1，可用于乳苣多酚含量測定。式中︰Y為765nm處吸光度;X為多酚質量(mg)。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 大孔吸附樹脂靜態吸附及解吸附乳苣多酚比較

三種大孔樹脂的基本特性見表1。影響大孔吸附樹脂吸附性能的因素較多，包括樹脂結構、極性、比表面積、粒徑、孔徑以及與被吸附分子的極性、分子大小等。多數多酚類化合物為弱極性分子，在非極性樹脂上吸附效果更好［14］。一般非極性樹脂易從極性溶劑中吸附非極性化合物，極性樹脂易從非極性溶劑中吸附極性物質，而中等極性樹脂不僅能從非水介質中吸附極性物質、也能從極性溶劑中吸附非極性物質。乳苣多酚靜態吸附和解吸附結果見圖2和圖3。由圖2可知，三種大孔樹脂對乳苣多酚均具有一定的吸附能力，在吸附初期均能快速吸附乳苣多酚，且幾乎成線性增長關系，150min后達到吸附平衡。D-101是非極性樹脂且比表面積最大，故吸附率最大，達到18.47%。雖然AB-8比表面積大于NKA-9，但其平均孔徑小于后者，限制了多酚的吸收，因此二者吸附率相差不大。吸附率順序依次為:D-101＞NKA-9＞AB-8。解析率主要取決于吸附樹脂和被吸附物結合力的強弱，D-101樹脂吸附非極性和弱極性的主要作用力為范德華力，而NKA-9樹脂吸附極性物質主要作用力為氫鍵，AB-8樹脂吸附作用力兩者均有。因此D-101吸附樹脂解析率最高，達到98.5%。由圖3可知，60%乙醇對三種大孔樹脂均具有較好的解吸附能力，且解吸速率較快，120min內達到解吸平衡。解吸速率依次為D-101＞AB-8＞NKA-9。結合三種大孔樹脂對乳苣多酚的吸附和解吸附能力可知，D-101對乳苣多酚具有最高的吸附率和解吸率，因此本實驗選擇D-101大孔吸附樹脂作為純化乳苣多酚的最佳樹脂，選擇150min為吸附平衡時間，120min為解吸平衡時間。

表1 三種大孔樹脂的基本特性Table 1 Fundamental characteristic of three types of macroporousresin

圖2 乳苣多酚吸附曲線Fig.2 Adsorption curve of polyphenol

2.3 動態吸附條件的確定

圖3 乳苣多酚解吸附曲線Fig.3 Desorption curve of polyphenol

2.3.1 不同乳苣多酚濃度和pH對吸附率的影響不同乳苣多酚濃度吸附平衡時對吸附率的影響圖見4(a)。由圖可知在0.05～0.2mg·mL-1范圍內，隨多酚濃度的增加吸附率逐漸增加，0.2mg·mL-1時吸附率最大，達到32.4%，隨后吸附率隨多酚濃度增加而減少，這可能是樹脂表面多酚分子過多，阻礙其它分子進入樹脂內部，從而影響了多酚分子在樹脂內部的擴散，導致吸附率下降。同時樣液濃度增加致使雜質與多酚競爭機會增大［15］，因此最佳上樣濃度選擇 0.2mg·mL-1。

圖4 乳苣多酚濃度(a)和pH(b)對吸附率的影響Fig.4 Influence of polyphenol concentration(a)and pH(b)on adsorption rate

不同pH吸附平衡時對吸附率的影響見圖4(b)。大孔吸附樹脂主要以范德華力與有機物結合，因此有機物的存在形式直接影響其在樹脂上的吸附效果［15］。實驗中未考慮堿性范圍，主要是多酚類化合物容易轉變為钅羊鹽，以鹽的形式存在不易被樹脂吸附，而且堿性條件下酚羥基容易氧化而使溶液顏色加深［16］。由圖可知，在pH較低范圍內，D-101樹脂對乳苣多酚的吸附率呈緩慢上升趨勢，主要原因是當溶液pH較小時，酚類物質糖苷鍵容易水解，影響樹脂對其吸附［17］;當pH=4時，吸附率最大;pH繼續增大時，吸附率下降，這是由于乳苣多酚具有酚羥基，在偏離其pK范圍內-OH基團上的H+可解離出來，以離子形式存在于水中，此時不易被樹脂吸附;在酸性條件下具有酚羥基結構的多酚大部分以分子狀態存在，可借助范德華力與樹脂發生物理吸附作用［18］，因此選擇pH=4作為最佳pH。

2.4 動態解吸條件的確定

2.4.1 解吸劑的選擇 由圖5可知，3種解吸劑在120min內解吸率以60%乙醇最高，達到了95.64%。其次為 60%丙酮、60%甲醇，分別為 75.56%、47.76%。另外蒸餾水的效果最差，實驗過程中幾乎未檢測到解吸率。考慮到甲醇、丙酮毒性較大，對后續工作不利［19］，且乙醇解吸效果好，安全方便，所以選擇乙醇為最佳洗脫劑。

圖5 不同洗脫劑的選擇Fig.5 Selection of different desorbent

2.4.2 乙醇濃度對解吸效果的影響 由圖6可知，在40%～60%乙醇范圍內，隨著乙醇濃度的增加解吸率逐漸升高，當達到60%乙醇時解吸率最高。乙醇濃度高于60%時解吸率降低，可能是由于乙醇濃度增大將其他與樹脂吸附的雜質也一起洗脫［20-21］;同時考慮到生產成本增加及乙醇揮發性增強等因素，選擇60%乙醇為最佳解吸附濃度。

圖6 乙醇濃度的選擇Fig.6 Selection of ethanol concentration

2.4.3 洗脫速率對解吸效果的影響 洗脫速率一般要求不能過快，否則洗脫帶寬且拖尾嚴重，但也不能過慢，否則延長生產周期［22］。由圖 7可知，2mL·min-1的洗脫峰形寬且洗脫液多酚含量最低［23］，3mL·min-1的洗脫峰雖然較窄，但洗脫液多酚含量不高，且拖尾嚴重。與1mL·min-1的洗脫速率相比較，0.5mL·min-1的洗脫速率雖然洗脫液中多酚濃度相對稍低，但其洗脫峰窄，且沒有拖尾現象。故選擇0.5mL·min-1為最佳洗脫速率。

2.4.4 洗脫體積對解吸效果的影響 經計算1BV約為20mL，由圖8可知，D-101樹脂吸附的乳苣多酚極易洗脫，當洗脫速度為0.5mL·min-1時，60%乙醇僅0.25BV時乳苣多酚可被洗脫檢測，為0.0727mg·mL-1;洗脫體積增至0.75BV時，多酚濃度達到最大值，為1.3861mg·mL-1。隨后洗脫效果開始下降，當洗脫液達3BV時，乳苣多酚基本洗脫完全，多酚濃度為 0.0473mg·mL-1。

2.5 乳苣多酚純化前后波長掃描比較

圖7 洗脫速率的選擇Fig.7 Selection of elution rate

圖8 乳苣多酚洗脫體積Fig.8 Elution volume of polyphenol

由圖9可以看出，純化前后樣品具有相似的紫外吸收光譜，在270～280nm和350～370nm處的吸收峰符合酚類化合物吸收特征［24-25］。相同濃度下純化后樣品光吸收值明顯高于粗提物，由此可見，D-101大孔吸附樹脂適合乳苣多酚的進一步純化。

圖9 乳苣多酚純化前后紫外吸收光譜比較Fig.9 Comparison of ultraviolet absorption of polyphenol

3 結論

通過對3種大孔吸附樹脂的吸附和解吸附特性的比較，可知D-101樹脂適合于乳苣多酚的純化。吸附和解吸附最佳實驗條件:D-101樹脂在150min達到吸附平衡，120min解吸平衡。最佳濃度為0.2mg·mL-1，pH4，解吸劑濃度為60%乙醇，洗脫速率為0.5mL·min-1，洗脫體積為3BV。結果表明，D-101樹脂成本低，操作簡單和周期短，適合乳苣多酚吸附和解吸附及大規模生產等。

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Purification of polyphenol in Mulgedium tataricum L.with macroporousresin

ZHOU Xiang-jun1，GAO Yi-xia1，ZHANG Hui-fang1，ZHANG Ji1，2，*
(1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China;2.Department of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China)

TS255.1

B

1002-0306(2012)12-0281-05

2011-10-20 *通訊聯系人

周向軍(1980-)，男，研究生，講師，主要從事天然產物研究與開發方面的研究。

天水師范學院重點學科支持項目(ZD08037);國家自然科學基金資助項目(50773064)。