雞胚蛋提取物對體外培養的脾淋巴細胞和巨噬細胞的影響

李 曦，尤 歡，楊嚴俊

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

雞胚蛋提取物對體外培養的脾淋巴細胞和巨噬細胞的影響

李 曦，尤 歡，楊嚴俊*

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

目的:以體外細胞實驗研究雞胚蛋提取物對免疫力低下小鼠脾淋巴細胞和巨噬細胞的影響。方法:以水和石油醚為提取介質，檢測雞胚水溶物(CEAE)和脂溶物(CEPEE)在10～500μg/mL濃度范圍內對脾淋巴細胞增殖、脾淋巴細胞分泌IL-2、巨噬細胞吞噬作用以及巨噬細胞產NO的影響。結果:雞胚蛋提取物能恢復免疫低下小鼠的免疫功能，CEPEE顯著地促進脾淋巴細胞增殖并分泌IL-2，而CEAE則對巨噬細胞的吞噬能力和分泌NO能力顯示出更強的刺激作用，兩種提取物均呈現出量效關系。結論:雞胚蛋脂溶物和水溶物分別作用于淋巴細胞和巨噬細胞，發揮正向免疫調節作用。

雞胚蛋，免疫力低下，脾淋巴細胞，巨噬細胞，細胞實驗

Abstract:Objective:To study the effect of embryonated egg extracts on splenocyte and macrophage of hypoimmunity mice by in vitro cell trials.Methods:Hydro-ligarine was applied as the extraction solvent to divide embryonated egg mixture to hydro-soluble(CEAE)and petroleum-ether-soluble(CEPEE)part.The investigation of immunomodulatory effect of CEAE and CEPEE consisted of splenocyte proliferation，IL-2 production，macrophage phagocytosis and NO production at concentration of 10～ 500μg/mL.Results:Embryonated egg extracts recovered the the immune function.CEPEE remarkably enhanced splenocyte proliferation and IL-2 production，while CEAE significantly contributed to the macrophage function(macrophage phagocytosis and NO production)，both in a dose-dependent way.Conclusion:The hydro-soluble and petroleum-ether-soluble parts acted on the splenocyte and macrophage respectively to up-regulate cell immunity.

Key words:embryonated egg;hypoimmunity;splenocyte;macrophage;cell experiment

在我國南方及東南亞一帶素有食用雞胚蛋以滋補身體的習俗，據稱有健脾胃、補腎健體之功效?，F代研究證明，雞胚蛋中富含蛋白質、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等)、脂類(蛋黃卵磷脂等)、脂肪酸(亞油酸等)及常量和微量元素(Ca，Cu，Zn 等)、維生素(A，B，C，E)［1］等營養物質。有學者以小鼠體內灌服實驗證實，雞胚勻漿混懸液能提高小鼠脾臟指數、促進小鼠淋巴細胞的增殖、增強溶血素活性和巨噬細胞吞噬能力以及延長小鼠力竭致死游泳時間［2-4］，對小鼠的免疫功能具有顯著的正向調節作用。機體免疫是由免疫器官和組織、免疫細胞和免疫分子組成的一個復雜的功能整體。前人對雞胚蛋免疫調節作用的研究多基于雞胚勻漿物的小鼠體內實驗，本文以水和石油醚為介質分離提取雞胚蛋的免疫調節成分，得到雞胚蛋脂溶物(CEPEE)和雞胚水溶物(CEAE)，通過體外細胞實驗比較二者對脾淋巴細胞和巨噬細胞的作用效果。從免疫細胞和免疫分子水平上初步探索雞胚蛋發揮免疫功效的機理，為雞胚蛋這一生物資源在保健食品中的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胚蛋 12d，安徽榮達生物科技有限公司;RPMI 1640、小牛血清、MTT、青鏈霉素溶液、臺盼藍、ConA、L-谷氨酰胺、0.2μm過濾器 均購自上海生工;IL-2 ELISA試劑盒 美國RD公司;注射用環磷酰胺Cy 江蘇恒瑞醫藥公司;其余試劑均為分析純;完全培養基 RPMI 1640添加5%小牛血清、1%青鏈霉素、1%L-谷氨酰胺配制而成;細胞裂解液 甲醇+0.01%醋酸溶液(1∶1);格里斯試劑 1%對氨基苯磺酸，0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，2.5%磷酸;環磷酰胺注射液 滅菌生理鹽水配制成80mg/kg終濃度注射液;清潔級昆明種雄鼠 上海斯萊克，6～8周齡，(20±2)g，造模小鼠細胞實驗前3d，每日腹腔注射0.25mL環磷酰胺注射液，建立免疫力低下小鼠模型。

DS-1型組織搗碎機 上海標本模型廠;冷凍干燥機 Labconco;23R型高速冷凍離心機 HealForce-Neofuge;倒置顯微鏡 奧林巴斯;MK3型酶標儀 Thermo-Multiskan;370型CO2培養箱 Thermo-Forma;IKA-RV10型旋轉蒸發儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備 12d雞胚蛋組織搗碎、凍干后儲存于-20℃冰箱備用。

以胃蛋白酶、胰酶先后水解雞胚凍干物(模擬體內消化過程)。加入與水體積等量的石油醚，磁力攪拌8h。8000r/min高速離心10min使混懸液分層，分液漏斗分別收集水溶部分和脂溶部分，水溶部分直接凍干得到雞胚水溶物CEAE，脂溶部分40℃旋轉蒸發去除石油醚，凍干，得到雞胚脂溶物CEPEE。用完全培養基將兩種提取物分別溶解成1mg/mL的母液，0.2μm過濾器過濾除菌，隨后再用完全培養基稀釋成以下五個濃度梯度:500、250、100、50 和10μg/mL。

1.2.2 實驗分組 細胞實驗分為以下13組:正常對照組(完全培養基)、模型對照組(完全培養基)、陽性對照組(終濃度為5μg/mL的ConA)、5個濃度梯度的CEAE和5個濃度梯度的CEPEE。鋪96孔細胞培養板時，除正常對照組給予正常小鼠細胞，其余各組均給予免疫力低下造模小鼠細胞。

1.3 測定方法

1.3.1 脾淋巴細胞增殖實驗 小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制備脾淋巴細胞懸浮液［5］。臺盼藍染色法計數細胞，存活率為95%。完全培養基調節細胞濃度為5×106cells/mL鋪板，向96孔板中加入脾細胞懸液100μL/well，37℃、5% 的 CO2培養箱適應性培養4h。4h后，按1.2.2實驗分組每孔加入100μL的樣品，共13組，每組5個復孔。CO2培養箱培養48h后，MTT法測定脾細胞增殖效果［6］。

1.3.2 脾臟細胞分泌IL-2水平 按1.3.1方法制備5×106cells/mL的脾淋巴細胞懸液，100μL/well鋪96孔板，再按1.2.2實驗分組加入100μL的樣品。因脾淋巴細胞體外分泌IL-2活性低，每孔需同時再加入終濃度5μg/mL的有絲分裂原ConA。培養48h后，離心收集上清液，-20℃保存，即為 IL-2待測樣品［7］。采用ELISA法，按照試劑盒指示的操作建立標準曲線，測定小鼠血清IL-2含量。

1.3.3 巨噬細胞吞噬中性紅實驗 小鼠脫頸致死，無菌取腹腔巨噬細胞［8］。計數細胞存活率95%，完全培養基調節細胞濃度為1×106cells/mL鋪板，向96孔板中加入巨噬細胞 100μL/well，37℃、5% 的CO2培養箱培養3h后，PBS洗板2次除去未貼壁細胞。按1.2.2實驗分組每孔加入200μL的樣品，每組五個復孔。培養24h后進行中性紅吞噬實驗，酶標儀測 540nm 吸光值［9］。

1.3.4 巨噬細胞NO釋放量的測定 取小鼠腹腔巨噬細胞 1 ×106cells/mL 鋪板，100μL/well，37℃、5% 的CO2培養箱培養3h，PBS洗板2次除去未貼壁細胞。按1.2.2實驗分組每孔加入200μL的樣品，每組五個復孔。CO2培養箱培養24h后，收集上清液100μL/well，加入格里斯試劑，室溫放置10min后于550nm下測吸光值。以NaNO2做標準曲線定量［10-11］。

2 結果與分析

2.1 雞胚提取物對脾淋巴細胞增殖的影響

圖1顯示小鼠經環磷酰胺造模后，其脾臟細胞增殖率明顯下降(p＜0.05)，說明環磷酰胺成功地建立了小鼠免疫力低下的體外實驗模型。而在給予雞胚提取物共同培養48h后，小鼠脾臟淋巴細胞得到刺激性增殖，高濃度的提取物(500、250μg/mL的CEAE和CEPEE)能使免疫低下小鼠的脾臟細胞增殖能力恢復到正常小鼠的水平?？傮w而言，兩種提取物的免疫刺激效果都隨著劑量的增加而增強，500μg/mL的CEPEE對免疫力低下小鼠脾細胞的增殖率達到78%，超過陽性對照物5μg/mL ConA的刺激效果。相較水溶性成分，脂溶性成分對免疫力低下小鼠的脾臟淋巴細胞增殖顯示出更強的刺激效果。

圖1 雞胚提取物對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effect of embryonated egg extracts on splenocyte proliferation

2.2 雞胚提取物對脾臟淋巴細胞分泌IL－2的影響

小鼠注射環磷酰胺之后，淋巴細胞分泌的IL-2含量顯著降低(p＜0.01)。而在終濃度為10μg/mL陽性對照物ConA的刺激下，IL-2含量顯著回升，恢復到正常脾臟淋巴細胞水平。除了10μg/mL的低濃度提取物，50～500μg/mL的雞胚提取物均對脾淋巴細胞分泌IL-2顯示出刺激作用，其中500μg/mL和250μg/mL CEPEE均能恢復IL-2含量至正常小鼠水平(p＜0.01)。同時，500μg/mL CEAE也顯示出較強的刺激作用(p＜0.05)。與脾淋巴細胞增殖實驗結果一致，在50～500μg/mL范圍內，同濃度的脂溶物均顯示出比水溶物更強的刺激脾淋巴細胞分泌IL-2的作用。

圖2 雞胚提取物對脾淋巴細胞分泌IL-2的影響Fig.2 Effect of embryonated egg extracts on splenocyte IL-2 secretion

2.3 雞胚提取物對巨噬細胞吞噬功能的影響

如圖3所示，相較正常小鼠腹腔巨噬細胞，模型對照組小鼠巨噬細胞的吞噬率明顯下降。而在給予雞胚提取物共同培養24h后，兩種提取物均能使免疫抑制巨噬細胞的吞噬能力恢復到正常水平，高濃度的CEAE顯示出較強的促進巨噬細胞吞噬中性紅的效果。不同于脾淋巴細胞增殖和分泌IL-2的實驗結果，水溶物對巨噬細胞顯示出比脂溶物更強的刺激作用，并且這種效果呈劑量依賴關系，500μg/mL雞胚水溶物顯示出比陽性對照物更強的刺激效果。

圖3 雞胚提取物對巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.3 Effect of embryonated egg extracts on macrophage phagocytosis

2.4 雞胚提取物對巨噬細胞產NO的影響

如圖4所示，有絲分裂原ConA(陽性對照)極顯著地促進了免疫抑制小鼠巨噬細胞產生免疫活性分子NO(p＜0.001)。CEAE也可刺激巨噬細胞分泌NO，并且隨著劑量的增加呈現出更強的刺激作用，在10～500μg/mL范圍內顯示出量效依賴性。相較CEAE，CEPEE對免疫力低下小鼠巨噬細胞釋放NO的影響不大。

圖4 雞胚提取物對巨噬細胞釋放NO的影響Fig.4 Effect of embryonated egg extracts on NO production of macrophages

3 討論

淋巴細胞是機體最主要的免疫細胞，檢測藥物對脾臟淋巴細胞增殖的影響是反映其免疫效果最直接的指標。脾臟擁有全身循環T淋巴細胞的25%，IL-2是T淋巴細胞的自分泌或旁分泌生長因子，IL-2是機體免疫調節網絡中的核心物質，其生物學作用以刺激T細胞增生和誘導淋巴細胞增殖活化為主，除此之外還有其他重要功能如刺激NK細胞、CTL、LAK細胞的活化和增殖，也能促使T淋巴細胞和NK細胞產生干擾素、腫瘤壞死因子等［12］。本實驗的研究顯示:雞胚提取物能夠有效地提高免疫力低下小鼠的脾淋巴細胞增殖率并促進其分泌IL-2，并且在10～500μg/mL的濃度范圍內呈現劑量依賴效果，并能夠恢復體外培養的免疫力低下小鼠脾淋巴細胞的非特異性免疫功能到正常水平。

除了發揮核心免疫功能的淋巴細胞之外，巨噬細胞對機體免疫的貢獻也不容忽視。巨噬細胞是機體早期抗感染的主要細胞，其吞噬功能是免疫系統維持自身內環境穩定的重要手段。除此之外，巨噬細胞還分泌NO，是機體非特異性免疫系統的重要防御分子，具有抗炎抗菌的作用，是巨噬細胞殺傷腫瘤細胞，參與抵抗細菌、真菌及細胞內原蟲和蠕蟲等感染的炎癥反應的重要因子［13］。實驗結果顯示:雞胚水溶物顯著地促進了免疫力低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，刺激免疫分子NO的產生，并且呈現量效關系;而脂溶物對巨噬細胞的刺激作用不顯著。

4 結論

雞胚提取物能夠恢復體外培養的免疫力低下小鼠的脾淋巴細胞和巨噬細胞的免疫功能，并且該作用隨著提取物濃度的增加而增強。其中，雞胚脂溶物主要作用于淋巴細胞，而雞胚水提物則能刺激巨噬細胞的免疫功能。它們作用于免疫細胞的差異性初步顯示出雞胚蛋免疫調節功能的機制，這也為雞胚免疫活性成分的篩選奠定了良好的基礎。

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Effect of embryonated egg extracts on splenocyte and macrophage in vitro

LI Xi，YOU Huan，YANG Yan-jun*
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

TS201.4

A

1002-0306(2012)12-0368-03

2011-10-19 *通訊聯系人

李曦(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術。