赭曲霉毒素A生成轉化及致毒機制的研究進展

郝俊冉，許文濤，2，黃昆侖，2，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

赭曲霉毒素A生成轉化及致毒機制的研究進展

郝俊冉1，許文濤1，2，黃昆侖1，2，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉屬(Aspergillus.sp)和青霉屬(Penicillium.sp)真菌產生的一種次級代謝產物，它的生成受溫度、水活度等的影響。檢測食品及飼料中OTA含量的基本方法有薄層層析法、高效液相色譜法和酶聯免疫吸附法。OTA因被認為與巴爾干半島腎病有關而引起全球的關注，研究發現，OTA具有腎毒性、肝毒性、免疫毒性、基因毒性等，并且主要是通過促進膜的過氧化反應，抑制線粒體的呼吸作用和影響細胞信號傳導通路中蛋白及關鍵因子的轉錄表達等來達到致毒效應。吸附、轉化、降解是OTA脫毒的主要方式。本文就OTA的檢測方法、生物合成、致毒機制和脫毒轉化的相關研究進展進行了綜述。

赭曲霉毒素A，檢測方法，生物合成，致毒機制，脫毒轉化

Abstract:As a secondary metabolite，ochratoxin A(OTA)was a mycotoxin produced by fungi of two genera:Aspergillus and Penicillium，and its production was influenced by temperature and water activity，etc.The basic methods for determination of ochratoxin A content in food or feed samples were Thin-layer chromatography(TLC)，High-performance liquid chromatography(HPLC)and Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).OTA was first grabbed global attention and concern for the hazard and impact that might account for the“Balken Endemic Nephropathy”(BEN).Moreover，researches had shown that:OTA was nephrotoxic，hepatotoxic，immunotoxic and genetoxic mainly through promotion of membrane peroxidation，inhibition of mitochondrial respiration and affect on the expression of some important protein or transcription factors in the signal transduction，etc.The main means to detoxify OTA were adsorption，transformation and degradation.Here，some advances on the determination and the mechanism of biosynthesis，toxicity，detoxification and biotransformation of ochratoxin A had been reviewed.

Keywords:ochratoxin A(OTA);determination;biosynthesis;mechanism oftoxicity;detoxification and biotransformation

赭曲霉毒素 A(mycotoxin ochratoxin A，OTA)是由青霉屬(Penicillium.sp)和曲霉屬(Aspergillus.sp)真菌產生的一種次級代謝產物，許多研究人員認為OTA是導致上世紀五十年代巴爾干半島地方性腎病的主要原因，并且已從人的血清［1］、尿［2］等中檢測到OTA。研究還發現，OTA具有腎毒性、肝毒性、基因毒性、致畸性、胚胎毒性等，毒性僅次于黃曲霉毒素，在赭曲霉毒素中毒性最強。OTA在1993年被IARC劃為2B類致癌物。誘導過氧化反應，破壞細胞內穩態，影響細胞信號傳導通路等是OTA致毒的可能途徑。OTA的穩定性強、不易降解，廣泛存在于糧食、飼料和糧谷類食物等中，動物食用了含有OTA的飼料還會導致體內殘留從而使動物制品被污染，這些殘留的OTA可以經由食物鏈進入人和動物體內，危害他們的健康［3］。OTA污染糧食與飼料是全球糧食、畜牧業生產與加工所面臨的一個重要問題。因此，明確OTA的生成機制，建立完善有效的檢測方法，進一步研究OTA的致毒機制，開發高效環保的脫毒方法是必要而緊迫的，這對提高糧食質量、保障人類及動物健康具有重要意義。

1 赭曲霉毒素A的理化性質

OTA結構式為7-羥基-5-氯-3，4，二氫-8-羥基-3-甲基異香豆素-7β-苯丙氨酸(圖1)，分子式為C20H18O6NCl，分子量為403.8。OTA是無色結晶化合物，在極性有機溶劑中高度可溶，微溶于水，溶于碳酸氫鈉水溶液［4］。由于苯基丙氨酸部分的羰基和異香豆素部分的酚式羥基，OTA的酸度系數pKa范圍分別為4.2～4.4和7.0～7.3。OTA從苯和二甲苯中再結晶時熔點分別為90℃和171℃，在96%乙醇中最大發射熒光是在467nm，在純乙醇中則為428nm［5-6］。

圖1 赭曲霉毒素A的結構Fig.1 The structure of OTA

2 赭曲霉毒素A的檢測方法

檢測食品及飼料中OTA含量的基本方法有薄層層析法(Thin-layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography，HPLC)和酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。這幾種方法各有利弊，且不斷進行改進以滿足實際需求。

2.1 薄層層析法(Thin－layer chromatography，TLC)

薄層層析法是較早應用于OTA檢測的一種方法，具體方法是:用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇-水提取樣品中的OTA，提取液經液液分析后，根據其在365nm紫外光燈下產生的黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標準品比較測定含量。薄層層析法可以進行毒素的定量和半定量檢測，廉價、易操作，能夠很容易的識別目標物質［7］，但是需要很好的了解樣品的性質以進行樣品前處理，存在靈敏度較差、耗時、試劑繁多、重現性差等缺點，已不能滿足現代檢測的需求［8］。

2.2 高效液相色譜法(High－performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC法檢測OTA是使用較多且被國際社會所認可的檢測方法，具有較高的靈敏度，可精確地對樣品中的OTA進行定性、定量分析，但儀器價格昂貴，對樣品的前處理要求高。近幾年高效液相色譜法與熒光檢測器、質譜(Mass spectrometry，MS)、電噴霧電離的串聯質譜(Electrospraytandem mass spectrometry，ESI-MS/MS)等方法聯合使用使得OTA的檢測更為方便和靈敏。

目前，對酒中OTA的檢測應用最廣的方法就是帶有熒光檢測器的高效液相色譜法，在檢測前要經歷免疫親和除雜步驟。這種方法最早是Visconti等［9］報道的。Al-Hazmi應用帶有熒光檢測器的HPLC法結合免疫親和層析柱分析了蘋果汁中OTA的侵染情況［10］。Bento等則應用此方法對葡萄牙某些地區的小麥面包進行了 OTA檢測［11］。Remiro等［12］還應用帶有熒光檢測器的HPLC，通過免疫親和性管柱分離純化第一次實現了紅酒中OTA及其結構類似物(OTB、OTC等)共現，并進行了同時定量。這也為毒素檢測提供了一種新思路。

由于高效液相色譜法和以前使用的薄層色譜法在檢測前均需要較長時間的樣品除雜，如液-液分流，固相抽提等，因此簡化除雜方法使OTA的定量選擇性和靈敏性更高成為研究熱點。Ghali等［13］應用免疫親和柱-高效液相色譜法(IAC-HPLC)對突尼斯180份食物樣本進行OTA分析，樣品萃取采用氰化甲烷/水(80∶20，v/v)，并通過免疫親和性管柱進行純化。使用氰化甲烷和酸化的水(2%的醋酸)作為流動相并根據阻滯時間不同進行樣品分離，重現性很好，310nm激發波、465nm發射波時，監測和定量限分別為0.lng/mL和 0.2ng/mL，只需要10g樣品即可進行OTA分析，簡化了除雜、液液分流、IAC清除等步驟，并且脫脂步驟中乙烷的使用等使得到的色譜圖更單一可信。

除此之外，Afsah-Hejri等［14］還針對花生中 OTA的HPLC檢測定量條件進行了優化，發現以下條件效果最好:流動相為5mmol/L的乙酸鈉(乙酸將pH調至2.36)/ACN/MeOH(40∶30∶30);激發波為 333nm;發射波為467nm;24℃，流速為0.4mL/min，檢測限為0.05ng/g。

2.3 酶聯免疫吸附法(immunochemical enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的原理是:在合適的載體上，酶標記的抗體(抗原)與相應的抗原(抗體)形成復合物，在酶底物存在時，復合物上的酶催化底物使其顯色。在一定條件下，酶降解底物程度和顏色深淺是成一定關系的，通過分光光度計測定OD值即可計算出參與反應的抗原和抗體的含量。

ELISA的核心反應為抗原抗體的特異結合，只需要較小體積的樣品且樣品除雜較快。因此ELISA簡單、快速、特異性好、靈敏度高，對樣品中OTA凈化純度要求不高，能同時對多個樣品定性或定量檢測，適于OTA批量檢測。但是相對于層析法，有時ELISA會產生系統的高偏差，抗體經常對與毒素相似的物質表現出交叉反應性能，造成假陽性［15］，檢測結果重現性差，酶穩定性差，因此一般需用其它方法驗證。Flajs等［16］對來自克羅地亞的紅酒和葡萄汁樣品進行酶聯免疫吸附和高效液相色譜法分析發現這兩種方法對OTA自然污染的酒樣的分析結果關聯性很好(r=0.821)，OTA濃度較高時關聯性則更好，但是與高效液相色譜法相比酶聯免疫吸附在檢測非常低濃度的OTA時則重復性差，效果不好。

除上述三種基本方法之外，用于OTA檢測的方法還有免疫親合柱―熒光光度法、時間分辨熒光免疫法、膠體金免疫層析技術和免疫傳感器法等。此外，越來越多新的檢測方法的出現為快速高效檢測樣品中的OTA提供了可能性。Zamfir等［17］近期利用高靈敏性的、不需要標簽的、有磁性的納米粒子分別與電化學阻抗光譜EIS和表面等離子共振SPR結合形成生物傳感器來檢測樣品中的OTA含量。發現前者檢測限為0.01ng/mL靈敏性較好，后者檢測范圍較大為1～50ng/mL，并且得到的結果與酶聯免疫吸附試劑盒結果一致，檢測效果很好。

3 赭曲霉毒素A的生成機制及影響因素

目前對于OTA的生成機制已經有一定的結果，因此，近幾年的研究重點就集中在影響OTA產量的菌株、生態生理學影響等方面。

3.1 赭曲霉毒素A的生成機制

研究發現，OTA的苯基丙氨酸部分來自于莽草酸途徑，二氫異香豆素部分來自于聚五酮途徑。異香豆素聚酮化合物合成的第一步是一個乙酸鹽基團和四個丙二酸鹽基團縮合在一起，該步反應需要聚酮合成酶的活化。聚酮化合物長鏈經過形成內酯環和羰基化修飾，并由氯化物過氧化物酶將氯原子加入形成OTα，最后，OTA合成酶催化OTα連到苯基丙氨酸，合成 OTA［18-23］。

3.2 影響赭曲霉毒素A產生的因素

3.2.1 產毒菌 OTA主要是由曲霉屬和青霉屬的某些真菌產生的次級代謝產物，但是在不同的生態位中由于環境條件、受侵染谷物種類不同，毒素爆發率及產毒菌的種類是不同的，如Dachoupakan等［24］的研究就發現，在葡萄中黑曲霉(Aspergillus niger)的生長與收獲區域和收獲年份有關?？傮w來說，在涼爽環境下主要的OTA產毒菌是青霉屬真菌，在熱帶地區則主要為曲霉屬真菌。

產OTA的青霉屬真菌一般分為兩類，一類是Penicillium verrucosum主要污染谷物，Penicillium nordicum和一些通過蛋白食物發酵所得的產毒菌株則被劃為第二類，主要在肉制品和奶酪中被發現。與P.verrucosum相比，P.nordicum菌株的OTA產量較低。這些青霉屬真菌一般分布于氣候涼爽的地域如北歐，加拿大等地。曲霉屬真菌中的 Aspergillus ochraceus是OTA的重要產生菌，在小麥、堅果、咖啡以及加工肉類以及煙熏的和鹽腌制的魚中常見。曲霉屬真菌產毒的第二類是黑霉真菌，Aspergillus carbonarius是最主要的一種，Aspergillus niger則是熱帶和亞熱帶植物尤其是葡萄和干果中OTA的主要產生菌，但是A.niger只有一部分菌株可產OTA。近年來也有實驗發現［25］，在可可豆中這兩種菌也可以產生OTA，但是產量較低。除此之外，有研究發現，Aspergillus alliaceus、 Aspergillus terreus、 Aspergillus fumigatus、Aspergillus versicolor等一些菌株也可以產生較低含量的 OTA［26］。

菌對生長環境有選擇性，對不同的農產品也有不同的偏好性，農產品中真菌菌群的組成和可能產生的毒素都將因為貯藏時間和貯藏條件而發生改變。

3.2.2 生態生理學因素 溫度、水活度和培養基成分等，這些因素都會影響產毒菌的生理機能及產毒效率，目前關于此類的研究較多。

P.verrucosum最佳生長溫度是30℃，水活度為0.80，被認為幾乎是谷物專一性的。Arroyo等［27］曾對面包中的P.verrucosum菌株進行研究發現在水活度為0.93，pH為6時，生長大約28～36d的菌株OTA產量最大。A.ochraceus和同屬的其他嗜溫種類Aspergillus westerdijkiae、Aspergillus steynii均能產生金棕色的分生孢子。它們的適宜生長溫度為24～31℃(8～40℃ 均可生長)，水活度為 0.95～0.99，pH 為3～10，有研究表明A.ochraceus中有些菌株在糧食中最適宜產毒條件為30℃，水活度為0.99［28］。Alborch等［29］在對玉米仁進行研究表明:A.niger和 A.carbonarius適宜生長溫度分別為 25～40℃和20～35℃，兩者在該溫度范圍內均可產OTA，但是在15℃時均產量最高，后者在20℃時也可達到該產量，且在水活度為0.98時產量要明顯高于水活度為0.96和0.92。Esteban等［30］的實驗也證明 A.carbonarius的一些菌株在15℃時OTA產量高于30℃。但是也有研究稱，在水活度為0.973，25℃時，A.niger的OTA產量最大，A.carbonarius的適宜生長溫度為25～35℃，產OTA的適宜溫度則為20℃和25℃。

對于農產品來說，影響OTA的產生和產量最主要的原因是農產品收獲時的環境，干燥條件及貯藏方式。谷物干燥的水分活度達到0.7以下，并且在貯藏過程中也保持該水平，能有效降低產毒菌的數量?；ㄉA藏時水活度保持在0.91以下則可以有效減少黑霉菌 OTA 的產量［31］。

除此之外，不同的農產品因為所含營養物質不同，因此侵染的菌株也有差異，這也會對OTA的產生條件有一定的影響。

4 OTA的致毒機理研究進展

目前的研究發現，OTA對動物和人類具有腎毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸性等［32］并且還具有植物毒性［33］，因此對于其致毒機理的研究是必要而緊迫的。研究發現，OTA能誘導活性氧的產生、線粒體的結構及功能的改變以及一系列生理生化介導因子表達的上調或者下降等，因此，研究者推測這些改變及其產生的一系列后續反應都有可能是OTA致毒的原因。

4.1 活性氧產生及其毒性結果

某些外源物質可以誘導氧化還原反應的進行從而能產生活性氧(ROS)，并能通過氧化還原敏感機制損傷信號轉導、調節基因表達從而引起氧化細胞損傷。活性氧的靶標是核酸、蛋白和脂質，以及一些小的生物分子(抗壞血酸、生物胺等)。和這些外源物質一樣OTA也能引起活性氧的生成，雖然OTA引起活性氧生成的生物機制仍然不是很明確，但是研究者普遍認為活性氧可以通過脂質過氧化、降低抗氧化酶活性、誘導DNA損傷等在OTA的致毒中發揮重要作用。

通過體外對大鼠肝、腎細胞的研究以及在體實驗，Rahimtula等［34］證明了OTA能增加脂質過氧化，并認為主要是由于促進了依賴NADPH和抗壞血酸鹽的脂質過氧化，而鐵離子(Fe3+)則是輔助因子。并且活性氧導致的脂質過氧化等后果可能會使DNA損傷發生。韓薇等［35］對敘利亞倉鼠腎細胞研究發現OTA能導致細胞活力下降，彗星DNA含量和拖尾現象與OTA呈明顯的劑量依賴關系，且經OTA處理的細胞中過氧化物歧化酶活力顯著降低。研究者認為OTA對腎細胞活力的影響與細胞內過氧化物的大量生成和抗氧化酶活力下降有關，且對細胞DNA造成損傷，引起細胞凋亡。通過中國倉鼠的卵巢細胞(CHO)和人的淋巴干細胞(TK6)中對OTA誘導的微核和DNA損傷的對比研究，Ali等［36］發現OTA濃度為15μmol/L即能誘導微核體產生和亞二倍體發生。且隨濃度增加在兩種細胞中都發現了DNA核苷酶(formamidopyrimidine-DNA glycosylase，fpg)敏感位點的增加，研究者認為氧化的DNA損傷和OTA侵染之間的一致性說明前者在OTA誘導產生的染色體斷裂和非整倍體中發揮作用。Sava等［37］則在對OTA神經毒性的研究中發現，OTA能誘導脂質過氧化和氧化的DNA損傷，形成對腦部的氧化壓力，并嚴重消耗腦部的紋狀體多巴胺。

4.2 線粒體呼吸鏈的抑制

線粒體是細胞中非常重要的細胞器，實驗證明，線粒體功能紊亂是OTA致毒的早期事件。OTA能夠抑制大鼠肝臟細胞的呼吸作用，導致ATP的消耗并對線粒體的形態有一定的影響。研究者認為可能的機制為:OTA通過競爭性抑制定位在線粒體內膜上的載體蛋白，從而導致線粒體內磷酸鹽轉運被抑制，或者是OTA抑制琥珀酸鹽相關的電子活動從而影響電子傳遞鏈［23］。

Bouaziz等［38］對人的肝癌細胞的研究認為，OTA主要是誘導了依賴于半胱天冬酶(caspase)的線粒體的凋亡通路，OTA能激活Bax，使其移位到線粒體膜上，線粒體的跨膜電勢消失，PTPC打開并釋放細胞色素c，這一系列反應誘導了O2-的產生，最終誘發了一個依賴于p53蛋白的細胞凋亡通路，而線粒體則在OTA誘導的細胞凋亡中發揮了中心作用。

4.3 對細胞信號轉導的影響

OTA可以對多個代謝通路的蛋白(包括酶)、調節因子的表達進行上調或下調，從而影響細胞中某些信號的轉導，通過非遺傳毒性機制來控制關鍵基因表達，這也可能是其致毒機理的一個重要方面。

Cosimi等［39］發現 OTA能有效地抑制中國倉鼠AA8細胞中核酶DNA拓撲異構酶II并能夠誘導多倍體產生，研究者認為是由于該酶在誘導核內復制細胞分裂時染色體沒有正確分離。并且該研究發現OTA能干擾染色體分離和有絲分裂進行的關鍵調節子如Cdk1，細胞周期蛋白B，Plk等，導致短暫抑制細胞有絲分裂或通過有絲分裂頻率降低等造成隨后的早熟，從而影響多倍體的形成。Cui等［40］對人的胃上皮細胞研究發現OTA能夠誘導胃上皮細胞停留在G2/M階段，在這些停滯的細胞中，經過OTA處理發現在M階段的細胞比例減小，含磷的組蛋白H3也減少，因此可以推測OTA是對G2階段產生影響而非M階段。OTA處理后，在蛋白水平和mRNA水平，細胞周期蛋白B1-Cdc2復合物和Cdc25C，Cdc2以及細胞周期蛋白B1均明顯降低。OTA能夠誘導胃上皮細胞凋亡，激活capase-3蛋白的分離。因此研究者認為由Cdc25C、Cdc2以及細胞凋亡蛋白B1介導的細胞凋亡和G2期的停滯可能是OTA胃毒性的早期事件。Boesch-Saadatmandi等［41］則通過對培養的腎小管細胞進行實驗發現，OTA降低了SOD超氧化物歧化酶的活性，增加了細胞內活性氧的水平，谷胱甘肽硫轉移酶的mRNA及其活性均降低。而能夠介導 GST基因轉錄的激活蛋白-1(AP-1)和NF-E2相關因子-2(Nrf 2)的超激活也被降低，研究者認為活性氧的增加以及GST活性的損害可能是由于AP-1和Nrf 2依賴性的信號轉導通路，這可能是OTA產生毒性的一個重要表現。

除此之外，也有研究者認為在OTA對細胞鈣穩態的破壞所導致的一系列的后續信號的改變也是OTA 致毒的一個原因［42］。

4.4 誘導細胞凋亡的產生

在多個實驗中均證明:OTA誘導的細胞變化能引起細胞凋亡。對細胞凋亡機理的研究也可能是揭示OTA致毒的一條途徑。

應用cDNA 微陣列技術 Lühe等［43］發現 OTA 能誘導小鼠體內腎臟細胞和體外腎近端小管細胞轉錄的變化。OTA改變了在 DNA損傷(GADD153和GADD45)和細胞凋亡(膜聯蛋白V和凝聚素)中發揮作用的一些基因，使之在轉錄水平上發生變化。Li等［44］則通過對非洲綠猴腎細胞和人的腎上皮細胞進行研究發現p53的活化能夠抑制由OTA產生的細胞凋亡作用。進一步研究表明p53能夠抑制JNK的活化，而JNK是通過下調Bcl-xL從而介導細胞凋亡通路，因此研究者認為p53在OTA介導的腎上皮細胞凋亡中發揮了重要作用。

4.5 與其他物質共同作用

OTA在食物及體內并不是單獨存在的，與其他物質的相互影響會決定其最終的毒性。這方面的研究還比較少，還有待進一步研究。

Ferrante等［45］在巨噬細胞系J774A.1的實驗中發現，OTA能調整脂多糖誘導的炎癥級聯反應，OTA濃度在30～100μmol/L時可表現出時間和劑量依賴性的細胞毒性效應，且在細胞脂多糖存在的情況下該毒性效應增加。而單獨存在脂多糖時并不對細胞穩定性造成影響。OTA濃度達到3μmol/L時能夠有效增加環化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和可誘導的一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達。但濃度達到10μmol/L時兩種酶的量都有所下降，并且，OTA與脂多糖共刺激時，這兩種酶及其代謝物對OTA的劑量依賴性均降低。這些結果說明，OTA在炎癥反應前就已經發揮作用，且能有效應答其他毒性物質的刺激如脂多糖，這也模擬了環境中兩種物質的共刺激。Rossiello等［46］通過對人體血液單核細胞進行研究發現單純添加OTA并不會影響單核細胞的組織因子(tissue factor，TF)和纖溶酶原激活物抑制劑-2(plasminogen activator inhibitor 2，PAI-2)的產生，但是對于脂多糖誘導的 TF和PAI-2卻能夠產生劑量依賴性的抑制效果，對于由IL-1β、TNF-α等刺激產生的TF也可以產生類似的抑制效果。研究者還通過抗原檢測和RNA分析表明OTA干擾了TF基因的轉錄。TF是凝血級聯反應的起始因子，PAI-2則能有效抑制纖維蛋白溶解，利于免疫炎癥反應中纖維蛋白的積累，在細胞介導的免疫應答中發揮重要作用。因此研究者認為OTA引起免疫抑制的機制為:OTA對于TF的抑制能夠減弱細胞的凝血活力，纖維蛋白的產生以及細胞的活化，除此之外OTA對PAI-2的抑制則能增加纖維蛋白的溶解，促進纖維蛋白的減少，這兩者均能進而影響細胞介導的免疫應答。Corcuera等［47］研究了OTA與黃曲霉毒素B1對體外HepG2的復合作用，發現這兩種毒素能夠制造更多的活性氧，但是OTA卻能減少黃曲霉毒素B1所導致的DNA損傷，如減少了黃曲霉毒素B1誘導的DNA加合物的產生。

除了上述之外，研究者還對OTA誘導DNA加合物的產生等進行了一系列的研究，但爭議較大［48-49］。

5 OTA生物轉化機制研究

5.1 脫毒中的生物轉化機制

由于OTA毒性強而且結構比較穩定，因此如何去除毒素成為一個亟待解決的問題。就目前的研究而言，一般是通過將毒素轉移、滅活、破壞、轉化為無毒的物質從而達到脫毒的目的，主要有物理脫毒、化學脫毒和生物脫毒三類方法。

5.1.1 物理脫毒 物理脫毒主要是通過吸附、輻照等手段達到脫毒的效果。Espejo等［50］對用于釀酒的葡萄汁進行了活性炭的吸附實驗，發現在活性炭為0.24g/L時可以吸附葡萄汁約70%的OTA。除了活性炭之外，在體外實驗中，目前比較有效果的有沸石、某些酵母等。但是在體內實驗中，除了活性炭之外其他均未達到預期效果，并且有可能會導致必需營養物質滯留和動物中毒［51］。通過吸附只是將毒素轉移并沒有將毒素破壞或者降解，因此還存在二次污染的問題。γ射線輻照，能破壞毒素結構從而脫毒，但是不易操作，需要專門的設備。

5.1.2 化學脫毒 化學脫毒主要是對毒素進行修飾等使之變為不具毒性的物質。堿性的過氧化氫，氫氧化鈉，氨基甲烷以及氫氧化鈣銨鹽能有效減少基質中的OTA。電化學技術產生的臭氧也能降低OTA。

5.1.3 生物脫毒 生物脫毒主要是通過生物代謝或者酶促反應降解毒素或者修飾毒素分子而達到脫毒的目的，并且以其脫毒效果好、對營養物質無損傷、污染小、快速等特點已成為目前的研究熱點。

羧肽酶是較早發現的能夠降解OTA的一種酶，除此之外也有某些金屬酶被發現可以降解OTA如梁曉翠［52］通過篩選，從土壤中得到的 BD189菌株在24h內能去除實驗體系中80%以上的OTA。經鑒定該菌株屬于莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的不動桿菌屬(Acinetobacter.sp)，通過后續實驗發現該菌株對OTA的脫毒方式為生物降解而非細菌細胞壁的物理吸附，降解OTA的產物為OTα，且沒有產生毒性更強的新毒性物質，達到了脫毒目的。并且BD189菌株降解OTA的酶是胞內金屬酶，降解OTA的時間曲線符合酶促反應的特征，其最適反應溫度為30℃，最適反應pH為8.0。

除此之外，屬于乳酸菌(Lactobacillus acidophilus VM20)［53］、不動桿菌［52］、酵母菌(Phaffia rhodozyma)［54］、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)［55］等屬的某些微生物和某些曲霉屬真菌(A.fumigatus，A.niger)［56］，在體外實驗中降解 OTA高達95%以上，并且他們中的一部分在體外實驗中也表現出降解特性且多數將OTA降解為毒性較小的OTα。微生物菌群，如牛和羊的瘤胃，小鼠的大腸和盲腸，人的腸道微生物，均可一定程度的降解OTA。

研究還發現，有一些物質雖不能直接脫毒但是卻可以抵消或降低OTA產生的毒性效應，例如:褪黑激素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)［57］，兒茶酚類物質［58］，維生素 E［5］等。

5.2 加工中所應用的脫毒手段

雖然OTA比較穩定，但是在特定的高溫、高酸、高堿及生物酶解則會發生結構的改變，因此，加工工藝對產品中OTA含量也是有影響的。

通過清洗除塵、清除壞掉的部分可以減少一部分OTA，但是去除量小(約2%～3%)且與農產品本身的狀況相關。研磨洗擦去掉糧食表皮也可以去掉表皮上積累的OTA。但是由于研磨并不是破壞或者降解毒素，可能只是將毒素重新分布或者導致研磨部件毒素的積累，這就引起了二次污染的問題。

OTA具有相對的熱穩定性，但是對于不同的溫度其穩定性則不同。例如烘焙餅干時可以導致部分的OTA被破壞或者被固定，當然其含水量低也在其中有一定的影響。通過對咖啡豆兩種不同的炙烤技術(旋轉圓柱形和流床式)分別在230℃下0、3、6、9、12、15min 和 0、0.9、1.7、2.6、3.5 和 4.3min 炙烤，對比后發現最長炙烤時間下OTA的減少率相似，且旋轉圓柱形效果很好，88%的OTA降解。但在該實驗中(230℃)并未發現OTA的完全降解，可能有水分參與的熱降解使之異構化成其他物質［59］。

在一些發酵食品中，酵母可以有效地降低OTA的含量，Masoud等［60］曾研究了阿拉比卡咖啡發酵中的酵母對A.ochraceus的生長和OTA的含量的影響，發現 P.anomala，P.kluyveri和 H.uvarum能抑制A.ochraceus的生長，并且在麥芽膏瓊脂培養基上，這三種酵母均能夠抑制 A.ochraceus產生 OTA。Cecchini等［61］還對白葡萄汁和紅葡萄汁發酵過程中酵母對OTA的含量變化進行了研究，發現酒精發酵結束后，OTA含量明顯降低，這主要為酵母降解吸收所致。

除此之外，燒烤、油炸、次氯酸鹽處理等工藝也能減少一部分OTA。

6 展望

赭曲霉毒素A毒性大、污染范圍廣、與人及動物的健康關系密切，因此如何清除OTA及其產毒菌是一項非常艱巨的任務。農產品從勞作、貯藏到加工成產品，整個過程的環境條件都要被嚴格控制，最大限度的降低產OTA菌株的污染和OTA的積累。建立快速、靈敏、操作簡便、成本低、自動化程度高的OTA檢測方法也是今后研究的一大趨勢。同時還應該加強對OTA致毒、降解、與其他毒素及食品藥品成分互作等機理的研究，并將理論成果轉化為技術成果不斷應用到食品安全評估上。

［1］Coronel M B，Sanchis V，Ramos A J，et al.Ochratoxin A in adult population of Lleida，Spain:Presence in blood plasma and consumption in different regions and seasons［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49(10):2697-2705.

［2］Coronel M B，Marin S，Tarragó M，et al.Ochratoxin A and its metabolite ochratoxin alpha in urine and assessment of the exposure of inhabitants of Lleida，Spain ［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49(6):1436-1442.

［3］Pattono D，Gallo P F，Civera T.Detection and quantification of ochratoxin A in milk produced in organic farms［J］.Food Chemistry，2011，127(1):374-377.

［4］彭曉麗.赭曲霉毒素A對擬南芥的毒理機制研究［D］.北京:中國農業大學，2010.

［5］馬永杰.VE對OTA引起小鼠腎毒性的緩解作用研究［D］.北京:中國農業科學院，2009.

［6］Herrera M，Herrera A，Ari?o A.Estimation of dietary intake of ochratoxin A from liquorice confectionery［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(8):2002-2006.

［7］楊家玲，岳田利，高振鵬，等.赭曲霉毒素A檢測方法的研究進展［J］.農產品加工，2008(6):4-7.

［8］Turner N W，Subrahmanyam S，Piletsky S A.Analytical methods for determination of mycotoxins:A review［J］.Analytica Chimica Acta，2009，632:168-180.

［9］ViscontiA，PascaleM，CentonzeG.Determination of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column cleanup and high-performance liquid chromatography ［J］.Journal of Chromatography A，1999，864:89-101.

［10］Al-Hazmi N A.Determination of patulin and ochratoxin A using HPLC in apple juice samples in Saudi Arabia［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2010，17(4):353-359.

［11］Bento J M V，Pena A，Lino C M，et al.Determination of ochratoxin A content in wheat bread samples collected from the Algarve and Bragan?a regions，Portugal:Winter 2007 ［J］.Microchemical Journal，2009，91:165-169.

［12］Remiro R，Ibá?ez-Vea M，González-Pe?as E，et al.Validation of a liquid chromatography method for the simultaneous quantification of ochratoxin A and its analogues in red wines［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217:8249-8256.

［13］Ghali R，Hmaissia-khlifa K，Ghorbel H，et al.HPLC determination of ochratoxin A in high consumption Tunisian foods［J］.Food Control，2009，20(8):716-720.

［14］Afsah-Hejri L，Jinap S，Mirhosseini H.Ochratoxin A quantification:Newly developed HPLC conditions［J］.Food Control，2012，23:113-119.

［15］Zheng Z，Hanneken J，Houchins D，et al.Validation of an ELISA test kit for the detection of ochratoxin A in several food commodities by comparison with HPLC ［J］.Mycopathologia，2005，159:265-272.

［16］Flajs D，Domijan A-M，Ivic＇D，et al.ELISA and HPLC analysis of ochratoxin A in red wines of Croatia［J］.Food Control，2009，20:590-592.

［17］Zamfir L-G，Geana I，Bourigua S，et al.Highly sensitive label-free immunosensor for ochratoxin A based on functionalized magnetic nanoparticles and EIS/SPR detection［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，2011，159(1):178-184.

［18］O’Callaghan J，Caddick M X，Dobson A D.A polyketide synthase gene required for ochratoxin A biosynthesis in Aspergillus ochraceus［J］.Journal of General Microbiology，2003，149:3485-3491.

［19］Gallo A，Perrone G，Solfrizzo M，et al.Characterisation of a pks gene which is expressed during ochratoxin A production by Aspergillus carbonarius［J］.InternationalJournalofFood Microbiology，2009，129:8-15.

［20］F?rber P，Geisen R.Analysis of differentially-expressed ochratoxin A biosynthesis genes of Penicillium nordicum ［J］.European Journal of Plant Pathology，2004，110:661-669.

［21］Steyn P S.The biosynthesis of mycotoxins ［J］.Revue de Medecine Veterinaire，1998，149:469-478.

［22］Harris J P，Mantle P G.Biosynthesis of ochratoxins by Aspergillus ochraceus ［J］.Phytochemistry，2001，58(5):709-716.

［23］Ringot D，Chango A，Schneider Y-J，et al.Toxicokinetics and toxicodynamics of ochratoxin A，an update［J］.Chemico-Biological Interactions，2006，159:18-46.

［24］Dachoupakan C，Ratomahenina R，Martinez V，et al.Study of the phenotypic and genotypic biodiversity of potentially ochratoxigenic black aspergilliisolated from grapes［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，132:14-23.

［25］Duarte S C，Pena A，Lino C M.A review on ochratoxin A occurrence and effects of processing of cereal and cereal derived food products［J］.Food Microbiology，2010，27:187-198.

［26］Sánchez-Hervás M，Gil J V，Bisbal F，et al.Mycobiota and mycotoxin producing fungi from cocoa beans ［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，125:336-340.

［27］Arroyo M，Aldred D，Magan N.Environmental factors and weak organic acid interactions have differential effects on control of growth and ochratoxin A production by Penicillium verrucosum isolates in bread ［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，98:223-231.

［28］Pardo E，Marín S，Sanchis V，et al.Prediction of fungal growth and ochratoxin A production by Aspergillus ochraceus on irradiated barley grain as influenced by temperature and water activity［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，95:79-88.

［29］Alborch L，Bragulat M R，Abarca M L，et al.Effect of water activity，temperature and incubation time on growth and ochratoxin A production by Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius on maize kernels ［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，147:53-57.

［30］Esteban A，Abarca M L，Bragulat M R，et al.Study of the effect of water activity and temperature on ochratoxin A production by Aspergillus carbonarius ［J］.Food Microbiology，2006，23:634-640.

［31］Astoreca A，Barberis C，Magnoli C，et al.Ecophysiological factor effect on growth rate，lag phase and ochratoxin A production by Aspergillus niger aggregate strains on irradiated peanut seeds［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，129:131-135.

［32］Pfohl-Leszkowicz1 A，Manderville R A.Ochratoxin A:An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans［J］.Molecular Nutrition ＆ Food Research，2007，51:61-99.

［33］王龑，許文濤，彭曉麗，等.赭曲霉毒素A(OTA)對擬南芥植物毒性的初步研究［J］.農業生物技術學報，2010，18(5):1079-1083.

［34］Rahimtula A D，Bereziat J C，Bussacchinni-Griot V，et al.Lipid peroxidation as a possible cause of ochratoxin A toxicity［J］.Biochemical Pharmacology，1988，37:4469-4477.

［35］韓薇，繆德年，張部昌，等.赭曲霉毒素A對BHK細胞毒害作用的研究［J］.南京農業大學學報，2010(4):87-92.

［36］Ali R，Mittelstaedt R A，Shaddock J G，et al.Comparative analysis of micronuclei and DNA damage induced by ochratoxin A in two mammalian cell lines［J］.Mutation Research，2011，723:58-64.

［37］Sava V，Reunova O，Velasquez A，et al.Acute neurotoxic effects of the fungal metabolite ochratoxin-A ［J］.Neuro Toxicology，2006，27:82-92.

［38］Bouaziz C，Sharafeldein O，Golli E E，et al.Different apoptotic pathways induced by zearalenone，T-2 toxin and ochratoxin A in human hepatoma cells［J］.Toxicology，2008，254:19-28.

［39］Cosimi S，Orta L，Mateos S，et al.The mycotoxin ochratoxin A inhibits DNA topoisomerase II and induces polyploidy in cultured CHO cells［J］.Toxicology in Vitro，2009(23):1110-1115.

［40］Cui J F，Xing L X，Li Z N，et al.Ochratoxin A induces G2 phase arrest in human gastric epithelium GES-1 cells in vitro［J］.Toxicology Letters，2010，193(2):152-158.

［41］Boesch-Saadatmandi C，Loboda A，Jozkowicz A，et al.Effect of ochratoxin A on redox-regulated transcription factors，antioxidant enzymes and glutathione-S-transferase in cultured kidney tubulus cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46(8):2665-2671.

［42］Marin-Kuan M，Cavin C，Delatour T，et al.Ochratoxin A carcinogenicity involves a complex network of epigenetic mechanisms［J］.Toxicon，2008，52(2):195-202.

［43］Lühe A，Hildebrandt H，Bach U，et al.A new approach to studying ochratoxin A(OTA)-induced nephrotoxicity:Expressing profiling in vivo and in vitro employing cDNA microarrays［J］.Toxicological Sciences，2003，73(2):315-328.

［44］Li J H，Yin S T，Dong Y H，et al.p53 activation inhibits ochratoxin A-induced apoptosis in monkey and human kidney epithelial cells via suppression of JNK activation［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，411:458-463.

［45］Ferrante M C，Raso G M，Bilancione M，et al.Differential modification of inflammatory enzymes in J774A.1 macrophages by ochratoxin A alone or in combination with lipopolysaccharide［J］.Toxicology Letters，2008，181:40-46.

［46］Rossiello M R，Rotunno C，Coluccia A，et al.Ochratoxin A inhibits the production of tissue factor and plasminogen activator inhibitor-2 by human blood mononuclear cells:Another potential mechanism of immune-suppression［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2008，229:227-231.

［47］Corcuera L A，Arbillaga L，Vettorazzi A，et al.Ochratoxin A reduces aflatoxin B1induced DNA damage detected by the comet assay in HepG2 cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49(11):2883-2889.

［48］Obrecht-Pflumio S，Dirheimer G.In vitro DNA and dGMP adducts formation caused by ochratoxin A ［J］.Chemico-Biological Interactions，2000，127:29-44.

［49］Mally A，Zepnik H，Wanek P，et al.Ochratoxin A:lack of formation of covalent DNA adducts ［J］.Chemical Research in Toxicology，2004，17(2):234-242.

［50］Espejo F J，Armada S.Effect of activated carbon on ochratoxin A reduction in“Pedro Ximenez”sweet wine made from off-vine dried grapes ［J］.European Food Research and Technology，2009，229:255-262.

［51］Amézqueta S，González E，Murillo-Arbizu M，et al.Ochratoxin A decontamination:A review ［J］.Food Control，2009，20(4):326-333.

［52］梁曉翠.不動桿菌BD189對赭曲霉毒素A的脫毒研究［D］.上海:上海交通大學，2010.

［53］Fuchs S，Sontag G，Stidl R，et al.Detoxification of patulin and ochratoxin A，two abundant mycotoxins，by lactic acid bacteria［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46(4):1398-1407.

［54］楊超.四種真菌毒素檢測方法的建立以及赭曲霉毒素A脫毒方法的初步研究［D］.青島:中國海洋大學，2009.

［55］牛天貴，梁志宏，計成，等.一株同時降解黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A的菌株的篩選、培養和應用［P］.中國專利:200810224726.8，2009.06.17 ［2011.09.14］.中華人民共和國知識產權局.

［56］Varga J，Rigó K，Téren J.Degradation of ochratoxin A by Aspergillus species［J］.International Journal of Food Microbiology，2000，59:1-7.

［57］Meki A-RMA，Hussein A A A.Melatonin reduces oxidative stress induced by ochratoxin A in rat liver and kidney［J］.Comparative Biochemistry and Physiology-Part C:Toxicology＆Pharmacology，2001，130(3):305-313.

［58］Costa S，Utan A，Cervellati R，et al.Catechins:natural freeradical scavengers against ochratoxin A-induced cell damage in a pig kidney cell line(LLC-PK1)［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45(10):1910-1917.

［59］Castellanos-Onorio O，Gonzalez-Rios O，Guyot B，et al.Effect of two different roasting techniques on the Ochratoxin A(OTA)reduction in coffee beans(Coffea arabica)［J］.Food Control，2011，22(8):1184-1188.

［60］Masoud W，Kaltoft C H.The effects of yeasts involved in the fermentation of Coffea arabica in East Africa on growth and ochratoxin A(OTA)production by Aspergillus ochraceus［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，106:229-234.

［61］Cecchini F，Morassut M，Moruno E G，et al.Influence of yeast strain on ochratoxin A content during fermentation of white and red must［J］.Food Microbiology，2006(23):411-417.

Research on the mechanism of biosynthesis，biotransformation and toxicity of ochratoxin A

HAO Jun-ran1，XU Wen-tao1，2，HUANG Kun-lun1，2，*
(1.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.The Supervision，Inspection ＆ Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

TS201.2

A

1002-0306(2012)12-0427-07

2011-09-13 *通訊聯系人

郝俊冉(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

國家社會公益性行業性科研專項(2008424083-2)。