CD3/CD28共刺激調節T細胞多重信號轉導通路的基因mRNA表達①

周俐斐 陳峰陽 李曉譽 徐世芳 葉益萍 (浙江省腫瘤醫院，杭州310022)

T細胞經特異抗原刺激激活，涉及信號轉導、基因的活化和轉錄、細胞因子分泌、細胞分裂和增殖分化等過程。T細胞活化需要兩種信號，一種是TCR/CD3與抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APCs)表面特異的MHCⅡ抗原肽復合物結合產生的特異性抗原刺激信號;另一種是非特異性協同刺激信號，如 CD154/CD40、CD28/B7、CD2/CD58、LFA-1(CD18)/ICAM-1(CD54)等，其中CD28/B7是最為重要的協同刺激分子，增加IL-2的產生，加速T細胞增殖，阻止細胞進入無能狀態或死亡［1］。T細胞內的信號轉導過程復雜多樣，雖然對 Ca2+、PKC、Ras、MAP/ERK、NFAT、NF-κB 等轉導通路有了較好的認識，但其活化的調控網絡尚未完全清楚［2］。

本實驗中，我們在體外用CD3/CD28共刺激小鼠T細胞活化，提取RNA后，采用“信號轉導通路發現者”PCR芯片(Signal Transduction PathwayFinder PCR Array)，觀察了18個不同信號轉導通路相關的84個關鍵基因的mRNA改變情況，對T細胞活化的基因調控過程進行了探討。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠，6周齡，18～22克，購于中國科學院上海實驗動物中心，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。實驗動物購得后飼養一周再進行免疫學實驗。

1．2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養基購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，臨用前加入100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清配制成完全培養液;胎牛血清(無菌、無支原體、無嗜菌體)購自杭州四季青生物工程有限公司;紅細胞裂解液購自碧云天生物技術研究所;T細胞純化尼龍毛柱購自日本和光純藥工業株式會社;功能級純化抗小鼠CD3e和CD28抗體購自美國eBioscience公司;小鼠IL-2 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒購自美國Qiagen公司;小鼠Signal Transduction PathwayFinder PCR Array(PAMM-014)購自美國Superarray公司;Bio-Rad 680型酶標儀為美國Bio-Rad公司;NanoDrop?ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計為美國Thermo公司;ABI PRISM?7900熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司。

1．3 小鼠T淋巴細胞的分離 按文獻［3］方法無菌取小鼠脾臟，制成單細胞懸液;以紅細胞裂解液裂解紅細胞，洗滌后以完全培養液混懸，調整濃度為1×108個/ml。以反向吸附法用尼龍毛柱純化T細胞［4］，收集細胞后以臺盼藍排斥法計數和計算存活率，以FITC-抗-CD3標記后流式細胞儀測定T細胞的純度。細胞存活率＞95%;T細胞純度＞85%。

1．4 CD3/CD28誘導T細胞增殖 于CD3e抗體包被的96孔細胞培養板中，加入T細胞(2×106個/ml)和CD28抗體。37℃、5%CO2培養24和48小時后，分別以MTT法測定T細胞增殖程度，結果以570 nm測定的吸光度A表示。

1．5 CD3/CD28誘導T細胞IL-2的分泌 于CD3e(5 μg/ml)抗體包被的96孔細胞培養板中，加入T細胞(2×106個/ml)和 CD28(1 μg/ml)抗體。37℃，5%CO2培養6、12、24 和48 小時后，分別收集細胞培養上清，以ELISA法按IL-2檢測試劑盒說明測定IL-2的含量。

1．6 CD3/CD28對T細胞信號轉導通路中基因mRNA表達的影響

1．6．1 細胞收集 于CD3e(5 μg/ml)抗體包被的24孔細胞培養板中，加入T細胞(2×106個/ml)和CD28(1 μg/ml)抗體。37℃，5%CO2培養 4 小時后，收集細胞。

1．6．2 RNA 提取和純化 Trizol提取 RNA，以DNaseⅠ消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。經RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒純化后的RNA，分別以變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收測定法觀察28S、18S核糖體RNA的條帶和測定A260/A280，檢測RNA質量，計算RNA濃度。

1．6．3 cDNA 合成 取 RNA 1．5 μg，加 oligo(dT)18(500 ng/μl)1 μl，10 mmol/L dNTP Mix 1 μl，加水補充至總體積13 μl，65℃水浴5分鐘后，冰上放置至少1分鐘。短暫離心后，在離心管中依次加入5×First-Strand Buffer 4 μl，0．1 mol/L DTT 1 μl，RNase Inhibitor 1 μl和 SuperScriptⅢ RT 1 μl，混合均勻。50℃溫育60分鐘，70℃ 溫育15分鐘使酶失活。加91 μl滅菌水混勻，置冰浴待用。

1．6．4 PCR反應 96孔板中的小鼠 Signal Transduction PathwayFinder PCR Array含有89個相關基因(包括 GUSB、HPRT1、HSP90AB1、GAPDH 和 β-Actin 5 個管家基因)。取 102 μl cDNA 加 550 μl 2×SuperArray PCR master mix和 448 μl雙蒸水混合，取10 μl置各孔中。將PCR Array置于實時定量PCR儀進行PCR反應，設置程序為:聚合酶激活/變性(95℃)10分鐘，擴增40個循環(95℃，15秒;60℃，1分鐘)，收集熒光。

1．6．5 采用 ΔΔCt方法分析數據 按公式:ΔCt(group 1)=average Ct-average of HK genes'Ct for group 1 array，計算每個處理組中的每個通路相關基因的ΔCt;按公式:ΔΔCt=ΔCt(組2)-ΔCt(組1)，計算2 個 PCR Array(或兩組)中每個基因的 ΔΔCt;通過2-ΔΔCt計算組2 與組1對應基因的表達差異。

2 結果

2．1 CD3/CD28誘導T細胞增殖和活化 CD28共刺激能明顯加強CD3誘導的T細胞增殖，CD3e 5 μg/ml和CD28 1 μg/ml的濃度已能有效地誘導T細胞在48小時內持續增殖(圖1)，激活T細胞，使IL-2的分泌量在24小時內迅速上升(圖2)。因此選擇該抗體濃度用于后續研究。

圖1 不同濃度的CD3/CD28誘導T細胞增殖(n=4)Fig．1 T cells proliferation induced by CD3/CD28 crosslinking with different concentrations(n=4)

2．2 CD3/CD28誘導T細胞信號轉導通路的基因mRNA變化 89個基因中，4個基因(Birc1a、Fgf4、Mmp7和Ptgs2)在CD3/CD28誘導的T細胞和未經誘導的T細胞中都沒有表達(循環數＞35);1個基因(Bmp2)在CD3/CD28誘導的T細胞中沒有表達;1個基因(Ccl2)在未經誘導的T細胞中沒有表達。因為熱休克蛋白在T細胞激活后會發生改變［5］，因此HSP90AB1未作為管家基因計算。倍數(Fold change)相差2倍認為表達有差異［6］。結果如表1和圖3所示，CD3/CD28共調節了43個基因，占檢測基因的51%，其中上調24個，下調19個，涵蓋檢測的所有18條信號轉導通路。

圖2 CD3/CD28誘導T細胞IL-2分泌(n=3)Fig．2 CD3/CD28 cross-linking induced IL-2 production in T cells(n=3)

圖3 CD3/CD28誘導T細胞信號轉導通路基因mRNA變化的散點分布圖Fig．3 Scatter plots for modulated genes in CD3 and CD28 cross-linking induced T cells

表1 CD3/CD28誘導T細胞信號轉導通路的基因mRNA變化Tab．1 Signal transduction genes mRNA found to be upregulated or downregulated in CD3 and CD28 cross-linking stimulated T cells based on PCR array

(續表1)

(續表1)

3 討論

T細胞在細胞介導的免疫反應中處于最為關鍵的位置，其激活受多重信號轉導過程的嚴格調控。共刺激信號先激活Lck、Fyn等 Src家族酪氨酸激酶(Src-related PTKs)，接著PTKs誘導跨膜蛋白或銜接蛋白LAT、TRIM、SLP76酪氨酸磷酸化，啟動下游一系列信號傳遞。Ca2+、PKC、PI-3K/AKT、Ras、MAP/ERK、NFAT、NF-κB等通路被認為是 T細胞主要的轉導網絡［2］。結果顯示(表1)，T細胞經CD3/CD28共刺激后，鈣與蛋白激酶C信號通路(Calcium and protein kinase C pathway)87．5%的基因發生改變;含Ras/MEK/Erk的促有絲分裂通路(Mitogenic pathway)及PI-3K/AKT通路均有50%的基因發生改變;NFAT和NF-κB通路均有66．7%的基因發生改變。除此之外，其他如 Wnt、Hedgehog、Jak-Stat、Phospholipase C、CREB等信號通路也有較多的基因都發生了改變。另外，如Fos、Ccnd1、Cdkn1a等基因參與多個信號通路的傳遞。以上結果表明，相互聯系的復雜的多重信號通路參與了T細胞的激活過程。

運用cDNA全基因芯片，Teague等［7］報道了小鼠T細胞體內經超抗原刺激8和48小時后的基因變化情況;Diehn等［8］研究了人外周血T細胞體外激活過程中基因1小時至48小時的動態變化;Shu等［5］也對小鼠T細胞經體外刺激18和48小時的基因變化做了觀察。但這些研究都未對信號轉導通路中基因的變化情況作專門的描述。另外，全基因芯片包含許多與研究對象無關的基因，其提供的數據會對分析與研究對象有關的基因產生干擾，提供無用(Inconsequential)或錯誤(Detrimental)的信息，而功能分類基因芯片(Real-time PCR芯片)可以剔除基因芯片上對研究對象無意義的基因，同時準確檢測上百個基因的mRNA水平［9，10］。本文首次采用功能分類基因芯片——“信號轉導通路發現者”PCR芯片研究了T細胞激活信號轉導通路中的基因變化情況，該結果有助于進一步認識T細胞的激活過程，控制和預防T細胞相關的免疫性疾病。

致謝:感謝上?？党缮锕こ逃邢薰驹赑CR array檢測中提供技術支持!

1 Salomon B，Bluestone J A．Complexities of CD28/B7:CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation［J］．Annu Rev Immunol，2001;19:225-252．

2 Lin J，Weiss A．T cell receptor signaling［J］．J Cell Sci，2001;114(2):243-244．

3 Chen F Y，Ni Y，Ye Y P et al．Comparison of immunosuppressive activity of Stephanoside E and its aglycone from Stephanotis mucronata in vitro［J］．Int Immunopharmacol，2010;10(10):1153-1160．

4 Gunzer M，Weishaupt C，Planelles L et al．Two-step negative enrichment of CD4+and CD8+T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail［J］．J Immunol Methods，2001;258:55-63．

5 Shu L，Yin W，Zhuang H et al．Comparison of gene expression profiles in mouse primary T cells under normal and prolonged activation［J］．Blood Cells Mol Dis，2006;37(1):64-75．

6 Zhang D，Al-Hendy M，Richard-Davis G et al．Antiproliferative and proapoptotic effects of epigallocatechin gallate on human leiomyoma cells［J］．Fertil Steril，2010;94(5):1887-1893．

7 Teague T K，Hildeman D，Kedl R M et al．Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(22):12691-12696．

8 Diehn M，Alizadeh A A，Rando O J et al．Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(18):11796-11801．

9 Wooster R．Cancer classification with DNA microarrays:is less more［J］．Trends Genet，2000;16(8):327-329．

10 Draghici S，Khatri P，Bhavsar P et al．Onto-Tools，the toolkit of the modern biologist:Onto-Express，Onto-Compare，Onto-Design and Onto-Translate［J］．Nucl Acids Res，2003;31(13):3775-3781．