空腸彎曲菌PEB1-LTB DNA疫苗構建及其對小鼠免疫保護性的研究

劉琳琳 (山東醫(yī)學高等專科學校病原生物學與免疫學教研室，臨沂276002)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是禽類腸道正常寄生菌，也是散發(fā)性細菌胃腸炎最常見的菌種。在發(fā)展中國家，空腸彎曲菌更是兒童腹瀉死亡的重要病原。且該菌與格林巴利綜合征有密切關系［1］。疫苗接種是預防其感染的有效途徑。

近年來，空腸彎曲菌疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗等，卻因不同血清型C．jejuni抗原分子結構差異，或潛在的周圍神經免疫性損傷等原因，使其相關研究未獲更多進展［2］。DNA疫苗為克服這些障礙提供了希望［3］。

本研究取空腸彎曲菌PEB1抗原基因和以大腸埃希菌不耐熱腸毒素LTB基因作為粘膜佐劑，構建PEB1-LTB融合DNA疫苗，經鼻粘膜免疫BALB/c小鼠，分析其免疫活性初步探討粘膜佐劑LTB對空腸彎曲菌PEB1誘導免疫應答的輔助作用，為空腸彎曲菌疫苗初步研究提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 菌株、質粒、實驗動物 空腸彎曲菌購自CDC(中國疾病預防控制中心);質粒pcDNA3．1(-)購自Invitrogen公司;大腸埃希菌(E．coli)JM109、人宮頸癌細胞系(Hela)為本實驗室保存;4～6周清潔級BALB/c小鼠購自山東大學動物實驗中心。

1．1．2 試劑 限制性內切酶 EcoR I、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶、小鼠細胞因子IFN-γ、IL-4檢測試劑盒購于TaKaRa;脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000購自Invitrogen;HRP標記羊抗鼠IgG抗體、生物素化羊抗鼠IgA、DNA marker(DL2000 plus)購自北京Trans-Gen;HRP標記親和素購自北京華美生物工程有限公司;引物由上海賽百盛生物技術有限公司合成;其他試劑均為國產分析純。

1．2 方法

1．2．1 PCR擴增基因片段 根據GeneBank公布PEB1、LTB序列及實驗目的設計引物。

以 C．jejuni總 DNA、E．coli全菌 DNA 為模板，P1、P2(PEB1);P3、P4(LTB)引物 PCR 擴增，獲得PEB1和LTB基因片段，反應條件:94℃ 10分鐘，94℃ 30秒，65℃/60℃ 30秒，72℃ 60秒，30個循環(huán)，72℃ 10分鐘。產物回收純化。重疊延伸PCR反應，P5、P6為引物，獲得PEB-LTB融合基因片段。反應條件:95℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，70℃ 1．5分鐘，5個循環(huán)后，改變反應條件:95℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1．5分鐘，72℃延伸10分鐘，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。

1．2．2 重組質粒的構建及在Hela細胞中表達 融合基因PCR產物與pcDNA3．1(-)質粒以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化產物，連接過夜。轉化E．coli JM109，雙酶切鑒定，篩選陽性菌落。

脂質體 LipofectamineTM2000、重組載體 pcDNA3．1(-)-PEB-LTB與Hela細胞共同培養(yǎng)36小時后收集細胞，細胞裂解產物經12%SDS-PAGE膠電泳，Western blot，鑒定蛋白表達。

1．2．3 DNA疫苗的制備及粘膜免疫接種 制備大量 DNA 疫苗［4］。PBS 稀釋至 1 μg/μl。BALB/c 鼠64只隨機數字表均分，即PBS對照組(A組);空質粒對照組 pcDNA3．1(-)(B 組);pcDNA3．1(-)-PEB1(C 組)、pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB(D 組)。接種采取滴鼻粘膜免疫方式。每種質粒20 μl/(只．次)，A組每次每只接種等體積PBS。

1．2．4 免疫小鼠標本的采集 小鼠每周免疫一次，共4次。每組隨機抽取8只，末次免疫2周后采血，制備脾淋巴細胞懸液，0．5 ml含0．25%蛋白酶抑制劑的PBS溶液沖洗氣管和小腸粘膜，收集沖洗液測定血清IgG和IgA、sIgA抗體;脾細胞上清液用于IFN-γ和IL-4細胞因子測定。

1．2．5 ELISA 法測定血清 IgG C．jejuni裂解液至包被96孔板，待測血清1∶50稀釋;二抗HRP-羊抗鼠IgG 1∶1 000稀釋;鄰苯二胺(OPD)顯色測定OD490。

1．2．6 生物素-親和素酶聯免疫吸附試驗(BSAELISA)檢測血清IgA和粘膜沖洗液sIgA C．jejuni裂解液包被96孔酶標板加入小鼠血清或粘膜沖洗液100 μl/孔，37℃ 1小時后加入生物素化羊抗鼠IgA 抗血清(1∶2 000)100 μl/孔，37℃ 1 小時，加入1∶2 000稀釋 HRP標記親和素，OPD顯色測定OD490。

1．2．7 脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ、IL-4的測定 96孔板中加入脾細胞懸液5×105/孔，伴刀豆球蛋白 A(ConA，5 μg/ml)50 μl/孔，空腸彎曲菌裂解液50 μl/孔，37℃培養(yǎng)24小時，收集上清，檢測 IFN-γ、IL-4。

1．2．8 攻擊試驗 每組剩余8只小鼠，末次免疫后第4周，分別于第1、3、7天以相同劑量(1 ml/只)，以C．jejuni(5×109CFU)灌胃攻擊。攻擊后每日觀察動物發(fā)病及死亡情況，計算每組疾病指數(評分標準:外表健康為0分;生病為1分;死亡為2分)，直至末次免疫后第8周。小鼠出現背部聳起、皮毛變卷、脫色、毛色灰暗和/神萎中任何一項或幾項視為生病［5］。以各組疾病指數之和除以當日被觀察動物數得該組疾病指數，根據以下公式計算疫苗保護率。疫苗保護率=(對照組疾病指數-免疫組疾病指數)/對照組疾病指數×100%。

1．3 統(tǒng)計學分析 SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計。各組間抗體和細胞因子水平比較用單因素方差分析，P＜0．05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 目的基因擴增 從 C．jejuni和 E．coli基因組DNA中分別擴增出約780、370 bp產物(圖1)，重疊PCR擴增獲得1 180 bp左右的重組基因PEB1-LTB(圖1)。

2．2 重組質粒 pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB鑒定 重組表達質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，產生1 180 bp和5 400 bp左右片段(圖1)，證明重組成功。

2．3 重組質粒的表達 脂質體介導重組質粒轉染Hela細胞，Western blot證實，43 kD處出現明顯的蛋白條帶(圖2)。

2．4 小鼠血清IgG和IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平 末次免疫后2周取血，D組中IgG、IgA抗體水平及氣管、小腸粘膜沖洗液sIgA抗體水平平均顯著高于其他各組(均P＜0．01)，C組IgG、IgA抗體水平及sIgA抗體水平顯著高于A、B組(均P＜0．01)。見表1。

2．5 小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子測定 末次免疫2周后，D組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平均顯著高于其他各組(P＜0．05，表2)。C組IFN-γ、IL-4水平顯著高于 A、B 組(P ＜0．01)。A、B和C組IL-4水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05，見表2)。

2．6 疫苗的臨床保護效應 經空腸彎曲菌重復攻擊后，D組疾病指數明顯低于其他各組(P＜0．01)。攻擊8周后，經重組DNA疫苗pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB免疫組小鼠幾乎均恢復正常，疫苗有效率高達92．95%。見表 3。

圖1 pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB的酶切和PCR鑒定Fig．1 Restrication indentification of pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB and PCR analysisNote:1．PCR product of PEB1 PCR;2．PCR product of LTB;M．DNA marker(DL2000 plus);3．pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB digested by EcoR I and XhoⅠ;4．PCR product of recombination gene PEB1-LTB．

圖2 重組PEB1-LTB融合蛋白的Western blot分析Fig．2 Western blot analysis of recombinant PEB1-LTB fusion proteinNote:1．pcDNA3．1(-);2．pcDNA3．1(-)-PEB-LTB．

表2 小鼠脾細胞上清中IFN-γ和IL-4水平±s)Tab．2 Levels of IFN-γ and IL-4 in splenocyte culture supernatants from immunized mice(±s)

表2 小鼠脾細胞上清中IFN-γ和IL-4水平±s)Tab．2 Levels of IFN-γ and IL-4 in splenocyte culture supernatants from immunized mice(±s)

Note:Compared with other groups，1)P ＜0．01;compared with groups A and B，2)P ＜0．01．

Groups IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)37±4 33±3 Group B［pcDNA3．1(-)］ 40±1 45±7 Group C［pcDNA3．1(-)-PEB1］ 1 273 ±802) 50 ±9 Group D［pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB］ 2 021±2561) 224±351)Group A(PBS)

表1 小鼠血清抗體IgG、IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平±s)Tab．1 Specific antibodies of IgG and IgA in the sera and sIgA in the mucosa douche of mice±s)

表1 小鼠血清抗體IgG、IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平±s)Tab．1 Specific antibodies of IgG and IgA in the sera and sIgA in the mucosa douche of mice±s)

Note:Compared with groups A and B，1)P ＜0．01;compared with group C，2)P ＜0．01．

A490 value IgG IgA sIgA Group A(PBS)Groups 0．092 ±0．015 0．279 ±0．036 0．129 ±0．016 Group B［pcDNA3．1(-)］ 0．137 ±0．030 0．263 ±0．019 0．361 ±0．028 Group C［pcDNA3．1(-)-PEB1］ 0．410 ±0．0601) 0．712 ±0．1401) 0．513 ±0．0911)Group D［pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB］ 0．636 ±0．1011)2) 1．092 ±0．1451)2) 0．889 ±0．1651)2)

表3 DNA疫苗免疫后的保護率Tab．3 Protective efficacy of DNA vaccines

3 討論

空腸彎曲菌是腹瀉常見病原菌，其發(fā)生率僅次于志賀菌所致的痢疾。人類主要通過糞-口途徑感染。粘膜抗菌感染免疫在抗該菌感染中起重要作用［6］。增強機體粘膜免疫可以有效預防空腸彎曲菌的感染。DNA疫苗經粘膜免疫后，能有效地激活B細胞分泌sIgA，通過封閉細菌表面上皮細胞結合位點、中和細菌毒素、滅活細胞內細菌等機制發(fā)揮重要免疫屏障作用［7］。本研究構建了基因重組DNA疫苗，采用粘膜免疫增強小鼠對空腸彎曲菌的免疫力，并研究了該 DNA疫苗誘導小鼠的免疫應答水平。

LT是腸產毒型大腸埃希菌分泌并保存于菌體周質中的一種外毒素，其B亞基(LTB)具有較強的免疫佐劑活性且無毒性，能有效增強局部粘膜的細胞及體液免疫應答，調節(jié)Th1/Th2反應的平衡，并促進IgG型的轉化和sIgA的分泌［8］。

空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1，基因序列相對保守，在不同血清型空腸彎曲菌中均有表達，是一種有效保護性抗原［9］。空腸彎曲菌 PEB1基因制備的DNA疫苗能夠有效地誘導 T細胞活化增殖［5，10］。但國內尚無空腸彎曲菌融合DNA疫苗的研究報道。

本研究構建了PEB1-LTB融合基因。構建所得重組表達質粒pcDNA3．1(-)PEB-LTB，通過脂質體轉入Hela細胞表達，Western blot分析，相對分子質量為43 kD，ELISA試驗呈現陽性，證實構建的PEB1-LTB DNA疫苗能表達具有相應免疫原性蛋白。

DNA疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，結果顯示，小鼠產生的IgG、IgA抗體及氣管、小腸粘膜沖洗液sIgA抗體水平平均顯著高于其他各組(P＜0．01)，說明疫苗經粘膜免疫小鼠，能誘發(fā)特異性體液免疫應答，而粘膜佐劑LTB能輔佐PEB1誘導小鼠產生更強的粘膜免疫應答:末次免疫2周后，D組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平均顯著高于其他各組(均 P＜0．05)。C組 IFN-γ水平升高，IL-4水平未發(fā)現顯著增加。重組DNA疫苗免疫小鼠后可激發(fā)機體的細胞免疫應答，聯合粘膜佐劑調節(jié)Th1/Th2反應的平衡。

實驗研究證明，重組PEB1-LTB DNA疫苗通過粘膜途徑免疫可獲得有效免疫保護性。小鼠攻擊實驗結果表明對小鼠的保護率達92．95%。該研究為經粘膜途徑感染病原體的疫苗研制進行有益探索，為臨床應用提供了重要的實驗依據。

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