應用聚偏氟乙烯-絲氨酸進行血液灌流治療膿毒癥的實驗研究

李 寧 周煥玉 張媛媛 周 巖 徐 放

河北大學附屬醫院重癥醫學科，河北保定 071000

內毒素血癥是造成膿毒癥的一個重要原因，血液中的內毒素（lipopolysaccharides，LPS）促使補體活化和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等多種促炎介質釋放，后者導致嚴重的外周血管阻力降低，低血壓和微循環障礙最終發展為組織缺血缺氧、休克和多器官功能衰竭[1]。筆者前期的動物實驗證實，應用聚偏氟乙烯-絲氨酸（PVDF-Ser）進行血液灌流，可有效清除膿毒癥豬的血漿LPS，降低TNF-α和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），最終降低72 h死亡率[2]。本研究旨在進一步證實其對感染性休克的血流動力學影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 大長種家豬16只，雄性，體重（22.3±3.5）kg，由河北大學動物實驗中心提供。依據隨機數字表分為兩組：PVDF-Ser組（E 組）8 只，LPS 給藥完成后 1 h，應用PVDF-Ser吸附膜進行血液灌流2 h，血流速50 mL/min；對照組（C組）8只，應用空白灌流器（容積與PVDF-Ser相同）進行血液灌流2 h。

1.1.2 實驗試劑 內毒素 （LPS from Escherichia coli 0111:B4，L2630）由SIGMA公司提供，鱟試劑由福建省廈門市鱟試劑實驗廠提供，檢測 IL-1β、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和高遷移率組蛋白-1（high-mobility group box-1 protein，HMGB-1）的 ELISA試劑盒由Bluegene公司提供。

1.1.3 實驗設備 蠕動泵由河北省保定市蘭格恒流泵有限公司提供（型號BT01-100），Servo300 型呼吸機由瑞典SIMENS公司提供，PiCCO由德國PULSION公司提供。

1.1.4 PVDF-Ser吸附膜 由浙江大學工學院合成提供（專利號200910100567.5），容積80 mL，有效吸附面積為4 830 cm2。

1.2 實驗步驟

1.2.1 麻醉：首先給予氯胺酮5mg/kg+咪達唑侖0.5mg/kg肌肉注射，然后咪達唑侖 6 mg/（kg·h）+芬太尼 60 μg/（kg·h）靜脈泵入維持。

1.2.2 所有動物均行經口氣管插管，機械通氣[容量控制模式：潮氣量6 mL/kg，頻率25次/min，吸入氧濃度 100%，呼氣末正壓 0 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）]。

1.2.3 兩側頸外靜脈穿刺置管用于血液灌流；右側頸內靜脈置入單腔深靜脈導管，連接溫度感知探頭；左側股動脈置入PiCCO動脈溫度壓力導管；左側股靜脈置入雙腔深靜脈導管，用于注射LPS、輸注液體和采集血樣。

1.2.4 復制內毒素致感染性休克模型：LPS持續靜脈泵入4 h，劑量 1 μg/（kg·h）[3]。 開始注射 LPS 后，輸注 0.9%的氯化鈉溶液 30 mL/（kg·h）。

1.3 血液標本采集、保存和檢測

分別于注射LPS前和完成注射后即刻、1、2、3、4 h采集血樣，依次記為T0～T5。標本立即在4℃的條件下離心3 000 g×10 min， 取血漿在-80℃條件保存。 測定 LPS、IL-1β、IL-8、IL-10 和 HMGB-1。

1.4 血流動力學指標的采集

分別于T0～T5測定有創平均動脈壓 （mean arterial pressure，MAP）、中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）、每搏輸出量指數（stroke volume index，SVI）、心排指數（cardiac index，CI）、體循環阻力指數（systemic vascular resistance index，SVRI）和全心舒張末期容量指數 （global enddiastolic volume index，GEDVI）。

1.5 統計學方法

全部數據分析應用SPSS 13.0統計軟件處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間基線數據的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，實驗中LPS、細胞因子和血流動力學參數的變化采用重復測量數據的方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內毒素及細胞因子水平

組間基線數據比較均無差異（P＞0.05）。注射LPS后，內毒素均明顯升高，組間比較無差異（P=0.089）；此后，內毒素水平均呈下降趨勢，但開始血液灌流后E組顯著低于C組。IL-1β、IL-8、IL-10 和HMGB-1 在注射LPS后均顯著增高，C組的升高趨勢持續到LPS注射結束后2 h，此后變為緩慢下降；而E組在開始血液灌流后即明顯降低，顯著低于C組，IL-10 在結束灌流后1 h已接近實驗前水平（P=0.132）。見表1。

2.2 血流動力學參數

兩組基線數據比較差異無統計學意義（P＞0.05）。給予LPS 后，兩組動物出現 MAP、CVP、SVI、SVRI和 GEDVI下降，CI則先升高后降低，符合感染性休克的典型改變。與C組相比，E 組行血液灌流后，MAP、SVI、CI、SVRI和 GEDVI均有顯著改善，這種效應持續到灌流結束后1 h。而CVP僅在血液灌流 2 h 后略有升高[（3±1） mm Hg vs （2±1） mm Hg，P=0.017]（1mmHg=0.133kPa）。與灌流前比較，E組中除CI在灌流2 h后回升、CVP無改善外，其他參數均在開始灌流1 h后即呈升高表現；而C組的多項指標呈進行性惡化趨勢。見表2。

3 討論

LPS作為革蘭陰性細菌的外層細胞壁的重要組成部分，當菌體繁殖或死亡后，其以游離形式或與菌體表層蛋白結合的形式釋放。與血漿LPS結合蛋白 （LPS-binding protein，LBP）形成復合物，到達粒單核細胞膜CD14分子（membrane CD14，mCD14）或與可溶性 CD14 分子（soluble CD14，sCD14）結合，sCD14/LPS復合物則進一步結合到CD14-的血管內皮細胞、上皮細胞。在跨膜蛋白Toll-like receptor家族(TLR)，尤其是TLR4的作用下，依次募集調節分子MyD88 和IL-1 受體相關激酶實現LPS信號從mCD14 到胞質的轉導。然后通過核因子κB途徑或氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶途徑造成細胞活化，大量炎癥基因表達，多種促炎和抗炎因子合成釋放，從而導致嚴重而失控的全身性炎癥反應，進一步發展為感染性休克、多器官功能障礙綜合征[4-5]。正是基于內毒素作為膿毒癥、感染性休克發生進展的始動和關鍵環節的認識，近年來大量研究證實，應用多黏菌素B等多種內毒素吸附劑進行血液灌流，可以有效清除血漿內毒素，控制炎癥介質水平，從而改善血流動力學紊亂和組織灌注，減輕氧化應激和呼吸氧合異常，最終降低膿毒癥病死率[6-8]。筆者前期的動物實驗證實應用PVDF-Ser進行血液灌流，可以有效吸附膿毒癥豬的血漿LPS，進而降低TNF-α和IL-6 水平，減輕肺、肝、腸等器官損傷，最終降低實驗組死亡率[2]。

血漿吸附、血液濾過等多種血液凈化措施用于治療膿毒癥和MODS的機制研究不斷深入，其中“峰值濃度學說”認為發生膿毒癥時機體免疫反應處于完全混亂的狀態，促炎和抗炎介質的峰值濃度可同時或先后出現，血液凈化是非選擇性清除這兩類炎癥介質，降低促炎介質的峰值濃度，減少其對內皮細胞和血流動力學的影響；降低抗炎介質的峰值濃度，保持了細胞對內毒素血癥反應性，恢復了機體的免疫能力[9]。Shimizu等[6]和Takwmi等[10]的臨床研究動物實驗結果均證實了如上觀點。本次實驗發現PVDF-Ser吸附膜在清除血漿LPS的基礎上，不僅有效控制IL-1β、IL-8的異常升高，亦可降低抗炎因子IL-10的血漿水平，從而重建機體的免疫穩態，提高 MAP、SVI、SVRI和 GEDVI，進一步驗證了以上假說和解釋了PVDF-Ser改善血流動力學紊亂的機制。

表1 血漿內毒素和細胞因子變化（±s）

表1 血漿內毒素和細胞因子變化（±s）

注：與組內T0 比較，aP＜0.05；與C組相同時間點比較，bP＜0.05，cP＜0.01

指標 T0（給予LPS前）T1T2T3T4T5（注射LPS后） （開始HP前） （HP 1 h后） （HP 2 h后） （結束HP 1 h后）LPS（EU/mL）C組E組IL-1β（pg/mL）C組E組IL-8（pg/mL）C組E組IL-10（pg/mL）C組E組HMGB-1（ng/mL）C組E組0.029±0.011 0.033±0.0150.476±0.150a 0.511±0.207a 0.403±0.083a 0.395±0.121a 0.349±0.104a 0.135±0.081ab 0.274±0.032a 0.079±0.053ac 0.247±0.091a 0.050±0.034b 47±8 42±10 522±157a 480±94a 671±103a 609±65a 769±224a 289±141ac 590±291a 202±30ab 514±109a 149±55ab 79±3547±40 1 004±337a 753±228a 2 336±748a 1 966±450a 3 085±534a 909±264ac 2 477±837a 580±95ab 1911±490a 304±125ab 183±58 224±30 1 440±219a 1 335±162a 1 992±541a 2 110±614a 2 277±451a 1 105±303ab 1 773±307a 623±179ab 1 557±489a 377±135b 21±12 17±1539±11 45±26a 55±32a 67±16a 80±28a 49±31ab 77±40a 34±22b 65±17a 29±19ab

表2 血流動力學參數變化（±s）

表2 血流動力學參數變化（±s）

注：與組內T0 比較，aP＜0.05；與C組相同時間點比較，bP＜0.05，cP＜0.01

參數 T0（給予LPS前）T1T2Ta Ta T5（注射LPS后） （開始HP前） （HP 1 h后） （HP 2 h后） （結束HP 1 h后）MAP（mm Hg）C組E組CVP（mm Hg）C組E組SVI（mL/m2 ）C組E組CI[L/（min·m2 ）]C組E組SVRI[dyn·s/（cm5 ·m2 ）]C組E組GEDVI（mL/m2 ）C組E組97±1590±11 73±20a 81±14a 63±16a 60±12a 51±10a 74±14ab 44±9a 83±21ac 47±11a 80±16ab 7±4 6±54±3a 3±1a 2±3a 2±2a 2±2a 2±3a 2±1a 3±1ab 2±2a 3±2a 38.3±3.60 34.9±2.40 22.3±2.70a 24.5±1.40a 18.1±3.80a 20.3±4.40a 15.3±2.10a 23.8±5.60ac 13.2±1.90a 29.2±4.00ab 14.6±3.00a 27.0±2.50ac 4.25±0.77 4.10±1.03 5.01±0.59a 4.81±0.34a 3.59±0.72a 3.66±0.43 3.18±0.95aa 3.54±0.50ab 2.90±0.26a 3.81±0.78ab 2.61±0.67a 3.74±0.13ab 1 426±370 1 291±205956±174a 868±239a 703±272a 727±155a 652±177a 804±210ab 603±84a 1 027±142ab 645±106a 1 003±399ab 558±93 503±47 375±114a 324±80a 329±68a 285±91a 266±64a 333±72a 283±40a 401±101ab 232±57a 445±69ab

現已證實，HMGB-1 在內毒素血癥和嚴重膿毒癥的病生理過程中扮演晚發炎癥介質的重要角色，大量釋放可激活炎癥反應、活化單核細胞和誘導內皮細胞的黏附分子[11]。Yuichiro等[12]對20例感染性休克患者應用多黏菌素B進行血液灌流，發現與死亡組相比，存活組的HMGB-1 顯著改善，提示可能通過降低HMGB-1的途徑，糾正感染性休克的循環衰竭。筆者的研究顯示，血液灌流2 h后，E組HMGB-1 較灌流前顯著降低[（34±22）ng/mL vs（67±16）ng/mL，P=0.007]，同時也明顯低于 C 組水平 [（34±22）ng/mL vs （77±40）ng/mL，P=0.024]。表明PVDF-Ser可能通過清除血漿HMGB-1 控制炎癥反應和改善血流動力學紊亂。

近來，大量動物實驗和臨床研究報道了多種內毒素和炎癥介質吸附治療在膿毒癥、感染性休克和MODS中的積極影響，提示未來它可能成為膿毒癥的重要治療手段[13]。筆者的實驗進一步證實了PVDF-Ser通過清除HMGB-1 和非選擇性清除促炎、抗炎介質的機制，在調節失控的嚴重炎癥反應和糾正血流動力學紊亂方面的有效作用，不失為膿毒癥和感染性休克血液灌流的有益嘗試。

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