懷牛膝中化學成分的分離與鑒定

楊柳，姜海，楊炳友，王秋紅，匡海學

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

懷牛膝為莧科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根，主產于河南。具有補肝腎，強筋骨，逐瘀通經，引血下行之功效，用于腰膝酸痛，筋骨無力，經閉癥瘕，肝陽眩暈［1］。藥理研究表明，懷牛膝具有抗生育、鎮痛、抗炎、增強免疫功能、抗衰老等作用［2－3］。前期實驗研究結果表明，牛膝水煎液的大孔樹脂50%乙醇洗脫組分具有抗骨質疏松活性，為了闡明其藥效物質基礎，對牛膝大孔樹脂50%乙醇洗脫組分進行系統的化學成分研究，曾報道從該組分中分別分離得到了新的甾酮類化合物［4］，在前期實驗的基礎上，利用硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜、制備型HPLC等色譜手段，進一步從牛膝中分離得到5個單體化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到。

1 儀器和材料

Bruker－400型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司，1H －NMR:400 MHz，13C －NMR:100 MHz);ACQUITY Ultra Performance LCTM液質聯用色譜儀;Delta 600－2487制備型 HPLC(美國Waters公司);制備型色譜柱 Hypersil－ODSⅡ(10μm，20mm ×300mm，大連依利特公司);硅膠(青島海洋化工廠，80～100，200～300目);薄層色譜用硅膠板(Silica gel60F254)和反相薄層板(Rp－18)(德國 Merck公司);柱色譜用反相ODS－AM(日本YMC公司);D101大孔吸附樹脂(南開大學化工廠);色譜層析用化學試劑為分析純(天津試劑一廠)。

Tab.1 13C －NMR data of compounds 1－2(in C5D5N，100 MHz，δ in ppm)

藥材經黑龍江中醫藥大學藥學院中藥資源教研室王振月教授鑒定為莧科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根。原植物標本保存于黑龍江中醫藥大學藥學院中藥化學教研室。

2 提取分離

將干燥的牛膝3kg，以水煎煮提取3次，每次2h，濾過，合并水提液，減壓回收，得水溶液提取物。水溶液提取物經D101型大孔吸附樹脂柱色譜，用H2O、50%EtOH和95%EtOH依次洗脫，其中50%EtOH洗脫液經減壓回收得50%EtOH洗脫組分(90g)。50%EtOH洗脫組分經硅膠柱色譜，以二氯甲烷－甲醇溶劑梯度洗脫，得到8個餾分(Fr.1－8)。Fr.2經正相硅膠柱色譜(二氯甲烷－甲醇)及反相ODS(甲醇－水)等方法得到化合物 3(54mg)、4(21mg)、5(27mg)。Fr.5經反相ODS(甲醇－水)及制備型HPLC(甲醇－水)等方法得到化合物1(32mg)、2(30mg)。

3 結構鑒定

化合物1:白色粉末，UV λmax:241.5nm，HR －ESI－MS(m/z):485.288 9［M+Na］+，表明其分子量為462，推測其分子式為 C27H42O6。1H －NMR(C5D5N)譜中，在 δ1.21、1.06、1.56 和 1.66 處出現 4 個甲基信號，在 δ6.25(1H，d，J=2.4Hz)處可見 1 個烯氫質子的信號。13C－NMR(C5D5N)譜中，出現27個碳信號，其中δ203.0為α、β－不飽和羰基上的一個酮羰基信號，δ166.1、122.0為三取代的雙鍵碳信號，通過以上數據初步推測為含27個碳的植物甾酮類化合物，具有甾酮類化合物的特征信號。除此以外，在δ4.74(1H，brs)和4.77(1H，brs)處還分別出現2個烯氫信號。據此推測化合物1中不僅存在α、β不飽和羰基結構外，另外還具有一個末端雙鍵。通過13C－NMR和HSQC譜的綜合解析，可知末端雙鍵存在于C25和C26間。將化合物1的1H－NMR、13C－NMR譜數據(見Table.1)與文獻報道的25，26－二去氫坡那甾酮A波譜數據［5］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物1為25，26－二去氫坡那甾酮 A(25，26－dehydroponasteroneA)。

化合物2:白色粉末，UV λmax:242.0nm，HR －ESI－MS(m/z):357.168 8［M+Na］+，表明其分子量為334，推測其分子式為 C19H26O5。化合物2的1HNMR和13C－NMR(C5D5N)譜中同樣出現了甾酮類化合物的特征信號，結合1H、13C－NMR譜，推測化合物2為含有19個碳的甾酮類化合物，可能其C17位的側鏈被氧化消失。δ200以上給出1個孤立的飽和羰基碳信號δ217.2，表明分子中具有五元環酮結構。將化合物2的碳譜數據與化合物1進行比較，發現其C1－C15位的化學位移基本沒有變化，而C17位變化很大，推測C17位側鏈消失，并羰基化。將化合物 2的1HNMR、13C－NMR譜數據與文獻報道的紅莧甾酮波譜數據［6］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物2為紅莧甾酮(rubrosterone)。

化合物3:黃色粉末，Dragendorff反應產生桔紅色沉淀，HR －ESI－ MS(m/z):359.124 1［M+Na］+，表明其分子量為336，推測其分子式為C20H18NO。13CNMR(CD3OD):δ106.6(C － 1)，150.0(C －2)，152.0(C －3)，109.4(C － 4)，28.2(C －5)，57.7(C － 6)，145.8(C －8)，152.2(C －9)，62.5(9 － OCH3)，146.4(C －10)，57.2(10 － OCH3)，121.9(C －11)，124.5(C－12)，128.1(C －13)。將化合物3的1H －NMR、13C－NMR譜數據與文獻報道的小檗堿的波譜數據［7］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物3為小檗堿(berberine)。

化合物4:白色粉末，Molish反應呈紫色，HR－ESI－MS(m/z):259.115 0［M+Na］+，表明其分子量為236，推測其分子式為 C10H20O6。13C－NMR(CD3OD):δ60.6(C －1)，32.6(C －2)，19.8(C －3)，14.1(C －4)，64.1(C －1')，101.2(C －2')，70.6(C －3')，72.1(C －4')，71.3(C －5')，65.0(C －6')。將化合物 4的1H－NMR、13C－NMR譜數據與文獻報道的正丁基吡喃果糖苷的波譜數據［8］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物4為正丁基吡喃果糖苷(n－butyl－β－D－fructopyranoside)。

化合物5:無色片狀結晶，易溶于甲醇，HR－ESI－MS(m/z):277.142 4［M］+，表明其分子量為 278，推測其分子式為 C16H22O4。13C－NMR(CD3OD):δ132.4(C －1，2)，129.9(C －3，6)，133.6(C －4，5)，169.3(C －1')，66.6(C －1″)，31.7(C －2″)，20.3(C －3″)，14.1(C － 4″)。將化合物 5 的1H － NMR、13C －NMR譜數據與文獻報道的鄰苯二甲酸二丁酯的波譜數據［9］相比較，兩者基本一致，所以鑒定化合物5為鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:67.

［2］ 孟大利，李銑.中藥牛膝化學成分和藥理活性的研究進展［J］.中國藥物化學雜志，2001，11(2):120 －124.

［3］ 董琦，郭新民，聶影，等.懷牛膝對2型糖尿病大鼠腦組織p75基因表達的影響［J］.中醫藥學報，2007，35(6):20 －21.

［4］ Qiuhong Wang，Liu Yang，Hai Jiang，et al.Three new phytoecdysteroids containing a furan ring from the roots of Achyranthes bidentata Bl［J］.Molecules，2011，16(7):5989 －5997.

［5］ Tiejun Ling，Zhengzhu Zhang，Tao Xia，et al.Phytoecdysteroids and other constituents from the roots of Klaseopsis chinensis［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2009，37(1):49－51.

［6］ 孟大利，侯柏玲，汪毅，等.中藥牛膝中的植物甾酮類成分［J］.沈陽藥科大學學報，2006，23(9):562 －564.

［7］ 孟大利.中藥牛膝化學成分及其生物活性的研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學，2004:37.

［8］ 汪濤，崔書亞，索有瑞，等.懷牛膝水溶性化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2004，29(7):649 －651.

［9］ 韋松，梁鴻，趙玉英，等.懷牛膝中化合物的分離鑒定［J］.中國中藥雜志，1997，22(5):293 －295.