UC-MSC移植對CIA大鼠炎癥因子表達水平的調控作用

李 慧 顧 健 林傳明 顧 薇 沈連軍

1.江蘇省蘇北人民醫院風濕免疫科，江蘇揚州 225001；2.江蘇省蘇北人民醫院血液科 揚州市血液學研究所，江蘇揚州 225001

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以累及周圍性小關節為主的系統性、炎癥性自身免疫疾病，以關節滑膜細胞增生、炎癥細胞浸潤及血管翳形成為主要病理特征[1]。臍帶間充質干細胞 （umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是來源于臍帶華通氏膠的一類多能干細胞，具有獨特的免疫調節功能，以抑制炎性反應為主要特征。本文以膠原誘導型關節炎（CIA）大鼠為研究對象，觀察UC-MSC對CIA大鼠炎癥細胞因子的調節作用，為臨床應用UC-MSC治療RA提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5 周齡，雌性，清潔級 SD 大鼠，90 只，平均體重（175±10）g，購置于南京大學模式動物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIA大鼠模型建立 ①分組:90只SD大鼠隨機分為三組:空白對照組、模型組、UC-MSC治療組，每組各30只；②造模:揚州大學醫學院實驗動物中心清潔級環境中適應性飼養1周，模型組及UC-MSC治療組在乙醚麻醉下于第1天以每只0.1 mL（含雞Ⅱ型膠原0.25 mg及0.05 mL完全弗氏佐劑）于SD大鼠右后足跖皮內注射，至第21天同前劑量于大鼠尾根部、左后足跖皮內再次多點激發免疫。空白對照組以生理鹽水注射，方法同造模組。

1.2.2 UC-MSC移植 取融合度 85%的 P3代 UC-MSC，用0.25%胰蛋白酶消化，生理鹽水清洗3遍，制成濃度為2×106/mL細胞懸液，用1 mL無菌注射器抽吸分裝成0.5 mL/支（含1×106個細胞）。于造模完成后1周經大鼠尾靜脈注射制備好的UC-MSC懸液0.5 mL/只；空白對照組及模型組同法注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標

1.3.1 從免疫當日起，采用雙人雙盲的方式在初免后1、2、3周，及治療后1～5周，每周觀察并采用關節炎指數（AI）評分法評定大鼠關節癥狀的嚴重程度。

1.3.2 于UC-MSC移植治療后第1、3、5周，分別取空白對照組及模型組、UC-MSC組大鼠，麻醉大鼠后，經腹腔靜脈取血4 mL置分離膠干燥管中，以3000 r/min、離心10 min后提取血清，置-20℃冰箱保存待測。用ELISA法檢測血清白介素-1（IL-1）、IL-10、IL-17、IL-18。

1.4 AI評分法標準

據關節紅腫范圍和變形情況對大鼠進行評估。每只大鼠四肢評分相加，總分最高為16分。評價標準:0分=無關節炎；1分=有紅色斑點或輕度腫脹；2分=關節部位中度腫脹；3分=嚴重腫脹，甚至皮膚破潰；4分=嚴重腫脹且不能負重。

1.5 統計學方法

采用Excel 2003軟件及統計軟件SPSS 16.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIA大鼠一般情況及關節癥狀

所有CIA大鼠飲食及活動減少，神疲乏力，體重增長減慢；于初次免疫后第2天注射處足踝、趾、膝關節即出現瘀斑、輕度紅腫；第6天開始紅腫加重，關節處皮膚充血發亮，甚至破潰，關節活動受限伴負重困難、活動障礙，紅腫逐步向對側后肢及雙前肢蔓延。空白對照組無上述表現，見圖1。

圖1 造模前后大鼠關節表現

2.2 各組不同時期AI評分結果比較

模型組及UC-MSC治療組CIA大鼠AI評分于初次免疫后第1周開始升高，至加強免疫后1周達最高，此后雖有下降，但仍維持在高水平狀態，與同時期空白對照組比較，差異均有統計學意義 （均P<0.05）；UC-MSC治療組大鼠經UC-MSC治療后AI評分逐漸降低，與同時期模型組比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表1。

2.3 各組不同時期血清 IL-1、IL-10、IL-17、IL-18 濃度比較

模型組 CIA 大鼠于治療后第 1、3、5 周 IL-1、IL-17、IL-18平均水平明顯高于同期空白對照組，差異均有統計學意義（均P<0.05），而IL-10水平明顯低于同期空白對照組，差異有統計學意義 （P<0.05）；UC-MSC治療組治療后第1、3周時IL-1、IL-17、IL-18水平較同期模型組顯著降低、IL-10水平逐步上升，差異均有統計學意義（均P<0.05），至第5周上述指標與空白對照組相近，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 不同組期大鼠關節炎指數AI評分（±s，分）

表1 不同組期大鼠關節炎指數AI評分（±s，分）

注:與同時期空白對照組比較，*P＜0.05；與同時期模型組比較，ΔP＜0.05

組別 只數 造模前 初次免疫1周初次免疫2周初次免疫3周加強免疫1周治療1周治療2周治療3周治療4周治療5周空白對照組模型組UC-MSC治療組3030300000004.56±0.12*4.47±0.31*6.79±0.54*6.11±0.44*8.23±0.33*8.13±0.42*0000009.65±0.28*9.60±0.19*8.15±0.19*7.34±0.41*Δ 7.98±0.41*6.29±0.16*Δ 7.35±0.63*5.68±0.22*Δ 7.31±0.27*4.67±0.55*Δ 7.52±0.18*3.01±0.72Δ

表2 各組不同時期血清IL-1、IL-17濃度結果比較（±s，pg/mL）

表2 各組不同時期血清IL-1、IL-17濃度結果比較（±s，pg/mL）

注:與同時期空白對照組比較，*P ＜ 0.05；與同時期模型組比較，ΔP ＜ 0.05

組別 只數 IL-1（pg/mL）治療1周 治療3周 治療5周IL-17（pg/mL）治療1周 治療3周 治療5周空白對照組模型組UC-MSC治療組30303033.08±8.1165.33±12.21*5.38±6.48*Δ 36.63±9.6657.70±5.09*42.16±8.24Δ 71.98±1.9866.20±0.79*74.42±2.58*Δ 73.77±1.8670.72±0.19*73.24±8.96Δ 75.60±6.5269.97±0.29*77.92±0.01Δ 34.24±4.3450.55±9.61*33.01±6.54Δ組別 只數 IL-10（ng/L）治療1周 治療3周 治療5周IL-18（ng/L）治療1周 治療3周 治療5周空白對照組模型組UC-MSC治療組303030168.72±29.56277.12±20.82*222.86±24.50*Δ 212.23±32.77317.16±38.85*234.46±28.41Δ 255.52±21.71325.50±28.39*250.56±27.22Δ 221.32±3.94250.03±10.48*232.72±3.85*Δ 210.79±2.97225.76±3.91*226.13±4.95*222.39±9.71222.82±1.83217.41±1.06*Δ?

3 討論

RA是一種慢性系統性自身免疫疾病，在其發生、發展過程中存在多種細胞因子分泌的異常。CIA大鼠是RA最常用、最經典的動物模型，其特征除病變關節炎性細胞浸潤、滑膜增生、關節軟骨及骨組織破壞外，還兼有體液免疫及細胞免疫功能紊亂的特點，其發病機制與人類RA有很多相似之處[2]。本文采用P3代UC-MSC治療CIA大鼠，以探討其對CIA大鼠炎性因子的免疫調節作用。

UC-MSC是來源于臍帶華通氏膠發育早期中胚層的多能干細胞，具有自我更新、高增殖分化潛能及免疫調節等功能的多能干細胞，無MHC的限制，效應呈劑量依賴性[3]。除能抑制促炎癥細胞的增殖和促炎性細胞因子的分泌之外，還能在特定的微環境中直接分化為各種組織細胞進行損傷修復[4]。

本研究觀察到，造模后CIA大鼠關節明顯紅腫、活動功能受限，AI評分亦逐漸增高，其血清IL-1、IL-17、IL-18水平明顯高于正常空白對照組，而IL-10水平則顯著降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。既往研究表明，IL-1是主要由單核細胞、巨噬細胞分泌的最具有多效性的細胞因子之一，可調節多種炎性細胞、免疫調節分子及前炎癥介質的表達，能導致細胞外基質的破壞與重建，加快RA的關節破壞進程，在RA的骨侵蝕及軟骨破壞中發揮重要作用[5]。IL-17主要由輔助性Th17細胞產生，可刺激成纖維細胞、上皮及內皮細胞釋放多種促炎癥細胞因子，并可誘導成纖維細胞表達細胞間黏附分子（ICAM-1）、促進T細胞增殖，以及與多種細胞因子協同放大炎癥反應，加劇RA關節的破壞[6]。IL-18是天然性和適應性免疫應答的重要調節因子。研究亦表明RA患者的血清和滑液中的IL-18均明顯升高，并且滑液中IL-18水平與RA活動呈相關性[7-8]，此外，IL-18可誘導軟骨細胞生成基質金屬蛋白酶MMP-1等而促進軟骨的降解[9]。IL-10是一種重要的炎癥抑制因子，主要是由活化的Th2細胞、單核細胞及B細胞產生，可抑制有核細胞分泌多種細胞因子IL-1、腫瘤壞死因子-α等以發揮抗炎作用，亦可抑制單核細胞表面分子的表達，降低單核細胞的提呈抗原能力，阻斷抗原特異性單核-巨噬細胞因子的產生。有研究認為，IL-10水平的降低可能會導致RA炎癥的發展和組織破壞的加重[10]。本研究中，經UC-MSC治療后IL-1、IL-17、IL-18水平逐漸降低、IL-10水平回升（P<0.05），至實驗觀察后期所有指標水平均接近空白對照組（P>0.05），實驗結果表明CIA大鼠體內存在免疫系統紊亂，導致促炎性細胞因子IL-1、IL-17、IL-18分泌異常增高，而炎癥抑制因子IL-10水平降低，機體處于促炎功能亢進、炎癥抑制功能缺陷的狀態，從而導致了疾病的發生與發展。UC-MSC可顯著降低CIA大鼠血清炎癥因子IL-1、IL-17、IL-18水平，而上調IL-10水平，通過其免疫調節功能恢復機體免疫系統平衡狀態，減少炎性物質的滲出，減輕炎癥反應，促進病變關節恢復。另外，有研究表明UC-MSC可靶向歸巢至炎癥病變部位，促進病變恢復。

總之，RA發病機制復雜，目前研究認為與機體免疫功能紊亂有關，其機體免疫功能處于紊亂狀態，使促炎癥細胞激活及功能亢進，而炎癥抑制細胞下調及功能缺陷，從而引起細胞因子的釋放及其他免疫細胞的活化、免疫球蛋白、趨化因子、氧自由基及白三烯等炎癥介質產生增多，進而引起關節血管炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞。本研究中采用的UCMSC具有獨特的生物學特性，既可在多環節上調節免疫，誘導免疫重建，恢復機體免疫系統平衡狀態；又可通過炎性趨化作用直接參與損傷的修復，并能分泌多種基質分子，改善局部受損微環境加速損傷修復，促進病變恢復，為臨床運用UC-MSC治療RA提供實驗依據。

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