慢性腦缺血大鼠腦星形膠質細胞反應性增生及EGb761的影響

仲玉潔

在中樞神經系統中，星形膠質細胞突起包繞神經元胞體及突起，構成神經元的微環境。它不僅支持、營養神經元，更能促進神經元的生長，提高神經元活力［1］。但是當慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI))時，星形膠質細胞過度反應性增生，可產生具有神經毒性作用的細胞因子，并可通過刺激小膠質細胞增殖、釋放細胞毒性物質和炎癥介質而發揮神經毒性作用［2］。反應性星形膠質細胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。本試驗通過對慢性腦缺血大鼠模型給予國際標準含量的銀杏葉提取物EGb761進行干預，觀察其對慢性腦缺血損傷后星形膠質細胞反應性增生的影響，為其在慢性腦缺血的預防和治療方面開辟新思路、提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠30只，體重(220±30)g，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分成3組:A組為假手術組，B組為單純缺血組，C組為EGb761干預組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 EGb761(達納康，按國際標準銀杏葉提取物要求選取，內含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯)，40 mg/粒，由法國博福-益普生制藥工業公司生產;GFAP抗體(膠質原纖維酸性蛋白抗體)，購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCI模型鼠的復制 參考Wakita等［3］方法制備動物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔內注射麻醉后，頸部備皮、消毒，頸正中切開皮膚，切口約1.5～2.0 cm，鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌，分離出雙側頸總動脈，每側用雙線分別在近心端和遠心端結扎，然后在兩結扎處之間剪斷頸總動脈制備出單純缺血組和干預組模型，假手術組僅分離雙側頸總動脈而不結扎，縫合切口，對皮并消毒，放回原環境中飼養。

1.3.2 給藥方法 將達納康研成粉末狀，用蒸餾水溶解并混勻，術后24 h按照0.5 m l/100 g予灌胃，單純缺血組給予等量蒸餾水灌胃，各組灌胃均為1次/d，持續12周。

1.3.3 標本的收集與處理 大鼠經麻醉后，常規生理鹽水及多聚甲醛灌注、固定，斷頭取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm)，采用免疫組化染色方法檢測腦組織皮層、胼胝體及海馬GFAP陽性細胞數的情況。

2 結果

大鼠腦膠質細胞GFAP的變化情況:各組均取皮層、胼胝體、海馬處進行觀察并統計GFAP陽性細胞數。單純缺血組GFAP陽性細胞數明顯多于假手術組和EGb761組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細胞表達情況(±s，n=10，個/400 倍高倍視野)

表1 各組大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細胞表達情況(±s，n=10，個/400 倍高倍視野)

注:◆干預組與單純缺血組比較P＜0.01，*單純缺血組與假手術組比較P＜0.01

組別 皮層 胼胝體 海馬假手術組12.9±1.66 17.0±1.49 10.5±2.55單純缺血組 28.2±1.87* 28.5±1.58* 24.3±2.46*干預組 19.4±1.43◆ 22.0±1.49◆ 16.6±1.51◆

3 討論

星形膠質細胞是中樞神經系統內在數目占絕對優勢的一類膠質細胞，被認為在神經元的整個發育過程中起重要作用［4］，它參與中樞神經系統內神經元功能的調節，在維持神經元的生存微環境中起著重要的作用。缺血性腦損傷后星形膠質細胞增生并產生許多生物活性物質，對缺血損傷神經元具有保護作用;而星形膠質細胞在缺血性腦損傷后過度的增生并產生的生物活性物質，包括谷氨酸、鉀、乳酸、花生四烯酸、NO和Ca2+流量變化等，反過來既可引起星形膠質細胞損傷和功能障礙，又可作為機械屏障影響髓鞘和軸索的再生，從而影響周圍神經組織的結構修復和功能恢復，所有這些因素則可影響神經元存活［5］。反應性星形膠質細胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。我們采用免疫組化GFAP標記星形膠質細胞的方法觀察各組大鼠腦組織中星形膠質細胞的表達情況，結果顯示，單純缺血組大鼠皮層、海馬、胼胝體內的GFAP表達較假手術組和干預組明顯增多，提示慢性腦缺血損傷后，腦組織中星形膠質細胞反應性的過度增生。

國際標準EGb761，含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯等多種活性物質，可協同作用于有關氧化應激、血液循環、神經遞質和炎癥反應等不同的病理過程。現已證實:EGb761中銀杏黃酮為自由基清除劑，銀杏內酯為特異性PAF受體阻滯藥，對缺血時的神經有保護作用。

本實驗應用EGb761對慢性腦缺血大鼠灌胃治療，觀察大鼠腦內星形膠質細胞數量的變化。實驗結果顯示EGb761干預組反應性星形膠質細胞增生的情況較單純缺血組明顯改善，提示EGb761能抑制腦缺血時星形膠質細胞的過度表達，這可能與EGb761能夠針對反應性星形膠質細胞增生的多種損傷機制，如氧自由基、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性作用和生物膜損傷等進行干預有關。盡管EGb761確實有神經保護作用，但其抑制星形膠質細胞過度增生的確切機制仍需深入研究。

［1］Ullian EM，Sapperstein SK，Christopherson KS.et al.Control of synapse number by glia.Science，2001，291(5504):657-661.

［2］Koprowski H，Zheng YM，Heber-Katz E，et al.In vivo expression of inducible nitric oxide synthase in experinmentally induced neurologic disease.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(7):3024-3027.

［3］Wakita H，Tominoto H，Kimurua J.Glia activation and whitematter change in the rat brain induced by chronic cerebral by hypoperfusion:an immunohistochemical study.Acta Neuropathol Ber1，1993，87:484-492.

［4］莫永炎，姜勇，陳瑗，等.腦星形膠質細胞生物學功能研究進展.生理科學進展，2002，33(1):71-74.

［5］熊暉，梁衛蘭.圍產期缺氧缺血性腦損傷中星形膠質細胞的病理生理改變.生理科學進展，2000，31(3):217-221.