杠柳苷元抑制人乳腺癌細胞增殖作用的研究

李海霞 韓琛 李一光

杠柳是主產于中國遼寧、吉林、河北、山東、山西等省區的一種蘿藦科植物［1］，其干燥的根皮即稱為“香加皮”，含有甾醇、酯類等多種化合物［2］，具有祛風濕、強筋骨、利尿、驅蟲、升壓等多種藥理功效［3］。

近年來，隨著中藥有效成分研究的進展，對于傳統中藥香加皮研究發現了多種不同于傳統應用的藥理學作用，例如抗炎作用［4］、強心作用［5］、抗癌作用［6］等，而其中杠柳苷元是香加皮產生抗炎作用的物質基礎［4］，并在香加皮抗腫瘤的過程中發揮了重要作用。為觀察杠柳苷元的體外抗乳腺癌細胞的作用，對其機制做較為深入的探討，特開展本實驗，為客觀評價和進一步開發研究其臨床應用價值提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 杠柳苷元由中藥香加皮提取純化而得到，純度大于98%;MCF7由沈陽藥科大學中日醫藥研究所惠贈;DMEM培養液購自Hyclone公司(UT，USA);胎牛血清購自TBD 公司(天津，中國)，proCaspase-9、Caspase-9、Caspase-3 抗體及辣根過氧化酶標記的二抗購自Santa Cruz公司(CA，USA)，MTT購自Sigma公司(MO，USA)。其他試劑均為分析純。使用的儀器為二氧化碳培養箱(NuAir，USA)，DYYIII28A型蛋白電泳儀(北京，中國)，酶聯免疫分析儀(Tecan，Austria)。

1.2 實驗方法 ①MTT法:取處于對數生長期的MCF7細胞，以1×105cell/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，培養18 h后，加入含有杠柳苷元(0-160 μm)的培養液，于37℃，5%CO2條件下繼續培養18 h，在顯微鏡下觀察細胞形態學的變化后，每孔加入 MTT 15 μl(5 g/L)，DMSO150 μl溶解后，于酶標儀492 nm處檢測，測定吸光值，并計算抑制率，繪制各點的抑制率反應曲線。

抑制率(%)=［A492(control)-A492(periplogenin)］/［A492(control)-A492(blank)］×100%。②蛋白免疫印跡法:將MCF7細胞以5×105cell/ml的密度接種于培養瓶中，每瓶8 ml，培養18 h后，加入濃度為0和75 μm的杠柳苷元，作用6、12、18 h后，用0.05%的胰酶將MCF7細胞消化下來，終止消化并將細胞混懸液離心。加入細胞裂解液冰浴裂解30 min，12000r/min離心10 min后提取上清，測定蛋白濃度，以10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白過夜轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后加入小鼠抗人Caspase-3、兔抗人Caspase-9以及兔抗人proCaspase-9孵育過夜，漂洗后加羊抗鼠或羊抗兔的二抗結合，漂洗后用TTBS洗膜，加入ECL顯影劑顯色后用膠片曝光，定影后得到上述蛋白的條帶。

2 結果

2.1 杠柳苷元對MCF7細胞生長和增殖的抑制作用。

如圖1所示，杠柳苷元以40 μm及以上的濃度作用于MCF7細胞18 h時，均具有明顯地抑制作用(P＜0.05)，且此抑制作用呈劑量依賴性。其半數抑制濃度為97 μm。

圖1 杠柳苷元對MCF7細胞的抑制作用

2.2 杠柳苷元對MCF7內相關凋亡蛋白的影響。

如圖1所示，當75 μM的杠柳苷元作用于MCF7時，能夠促進細胞內凋亡蛋白casepase-3蛋白的表達以及proCaspase-9轉化為Caspase-9，且促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3在細胞內的表達呈時間依賴性地增加。

圖2 杠柳苷元對MCF7內相關凋亡蛋白的影響

3 討論

目前普遍認為惡性腫瘤化學治療藥物引起腫瘤消除的機制是促進腫瘤細胞死亡和阻止其增殖，細胞死亡既可以通過壞死又可通過凋亡的形式進行［7］。細胞凋亡成為惡性腫瘤藥物治療的新目標，越來越多的研究成果使人們從細胞凋亡角度設計新的抗腫瘤治療策略、提高藥物治療效果［8］。

Caspase家族在細胞死亡信號傳導過程中起核心作用，Caspase-3是Caspase家族中最重要的細胞凋亡執行者之一，在蛋白酶級聯切割過程中它處于核心位置，發揮著非常重要的作用，一旦被激活就會導致細胞凋亡，因此被稱為促凋亡蛋白。它可以通過死亡受體介導途徑與線粒體依賴途徑來誘發細胞凋亡。Caspase-9也是凋亡過程中的重要蛋白，當存在于細胞膜表面死亡受體與相應的配體結合后，作為起始凋亡蛋白的proCaspase-9被剪切活化為Caspase-9，進一步激活下游的Caspase-3蛋白，最終引發細胞凋亡［9］。本次研究發現杠柳苷元可以時間依賴性地促進細胞內凋亡蛋白Caspase-3的增加并促使凋亡蛋白前體proCaspase-9剪切活化生成Caspase-9，說明杠柳苷元發揮抗腫瘤作用可能是通過促進腫瘤細胞凋亡來實現的。

1987年Hideji Itokawa等首次報道香加皮的氯仿一甲醇(10∶1)洗脫部位有抗腫瘤作用并從中分得杠柳苷元［10］，但在此之后關于杠柳苷元的藥效物質基礎研究及其抗腫瘤研究并不多見，關于其抗腫瘤的機制更是知之有限。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測發現經75 μM杠柳苷元作用后的MCF7細胞中proCaspase-9的表達量明顯呈時間依賴性地降低，而Caspase-9的表達量增加，由此推測杠柳苷元能夠誘導MCF7細胞凋亡可能是通過增加Caspase-9表達，進一步激活下游凋亡蛋白Caspase-3，而 Caspase-3表達增加，誘導下游蛋白表達，最終誘導細胞凋亡。

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志．北京:科學出版社，1977:273-274．

［2］ 張援虎，王鋒鵬.杠柳屬植物化學成分研究進展.天然產物研究與開發，2003，15(2):157-161．

［3］ 國家藥典委員會.中國藥典一部．北京:化學工業出版社，2005:181．

［4］ Yi-Na Zhu，Wei-Min Zhao，Yi-Fu Yang，et al.Periplocoside E，an Effective Compound from Periploca sepium Bge，Inhibited T Cell Activation in Vitro and in Vivo．The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2006，316(2):662-669．

［5］ 李玉紅，高秀梅，張伯禮，等.香加皮提取物對離體心臟功能的影響．遼寧中醫學院學報，2005，7(4):396-397．

［6］ 陳書紅，楊峻山，任風芝，等.香加皮的抗腫瘤活性成分研究．中草藥，2006，37(4):519-520．

［7］ Park JA，Kin KW，Kin SI，et al.Caspase3 specifically cleaves p21WAF1/C IP1 in the earlier stage of apoptosis in SK-HEP-1 human hepatoma cells．Eur J Biochem，1998;257(1):242-248．

［8］ Kim HE，Oh JH，Lee SK，et al.Ginsenoside Rh2 induces apoptotic cell death in rat C6 gliomal via a reactive oxygen and caspase-dependent but Bcl-X(L)-independent pathway．Life Sci，1999，65(3):33-40．

［9］ Ruiz-Vela A，Korsmeyer SJ.Proapoptotic histone H1.2 induces CASP-3 and-7 activation by forming a protein complex with CYT c，APAF-1 and CASP-9.FEBS Lett，2007，581:3422．

［10］ Hideji Hokawa.Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploea Sepium．Chem Pharm Bull，1988，36(3):982-988．