超臨界逆向蒸發(fā)法制備葡萄糖脂質(zhì)體實驗及性能表征

陳淑花，詹世平，張 晶，陳 理

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116622）

脂質(zhì)體是指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的球狀載體制劑，其結(jié)構(gòu)多為一層或多層同心脂質(zhì)雙分子層，外層由磷脂雙分子層包覆，內(nèi)部為水相內(nèi)核，具有類細胞膜結(jié)構(gòu)與功能。其水相內(nèi)核可以攜帶親水性藥物，雙分子層結(jié)構(gòu)可攜帶親脂類藥物，因而是一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ乃幬飩鬟f系統(tǒng)媒介[1-3]。脂質(zhì)體制備方法主要有逆向蒸發(fā)法、冷凍干燥法、pH梯度法、Bangham法等[4-6]。這些制備方法對脂溶性藥物包覆率效果較好，而對水溶性藥物包覆效果還不理想。在臨床藥品中，水溶性藥物占有很大的比例，因此提高脂質(zhì)體對于水溶性藥物的包覆效果成為目前亟待解決的問題。

超臨界流體逆向蒸發(fā)是近年來提出的一種用超臨界流體代替有機溶劑的脂質(zhì)體制備方法，具有制備過程簡單、對水溶性藥物包覆率較高等特點[7-10]。本文利用葡萄糖作為模型藥物，對其進行脂質(zhì)體制備研究，詳細考察該工藝條件對脂質(zhì)體包覆率的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

L-α-Phosphatidylcholine（sigma）：磷脂酰膽堿；乙醇：助溶劑，沈陽新興試劑廠；D-葡萄糖：天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心提供；CO2氣體，大連市氣體中心，純度99.9%。

1.2 實驗裝置與脂質(zhì)體制備

實驗裝置如圖1所示，設(shè)計壓力40 MPa、設(shè)計溫度室溫～80 oC，高壓反應(yīng)釜有效容積為200 cm3，壓力表與溫度表的精度分別為±0.01 MPa、±0.1 oC。

圖1 超臨界逆向蒸發(fā)過程裝置示意圖

大豆卵磷脂與乙醇、葡萄糖制成溶液，經(jīng)超聲振蕩后加入到反應(yīng)釜中，加壓至實驗所設(shè)定的壓力，保壓一定時間，緩慢釋壓后得到脂質(zhì)體樣品。

1.3 葡萄糖脂質(zhì)體包覆率測定

取實驗制備的脂質(zhì)體溶液1 mL放入透析袋中，封閉好透析袋后放置于干燥的燒杯中，精確加入50 mL二次去離子水，在Ph = 7的環(huán)境下透析24 h，之后取透析液25 μL放入生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）中檢測葡萄含量。由下式確定脂質(zhì)體對葡萄糖的包覆率[11]：

2 結(jié)果及討論

2.1 壓力對葡萄糖包覆率的影響

實驗設(shè)定溫度55 ℃，壓力分別為10、12、15、18、20、23和25 MPa下制備脂質(zhì)體，圖2給出了脂質(zhì)體包覆率隨壓力的變化曲線。

圖2 葡萄糖包覆率隨壓力變化關(guān)系曲線

當壓力從10 MPa增加到18 MPa時，脂質(zhì)體內(nèi)部壓力隨之增加，體積大的脂質(zhì)體破裂形成體積小的，體積小的脂質(zhì)體也會進一步收縮以增加內(nèi)部壓力維持體系平衡，這種變化等同于增加了體系內(nèi)脂質(zhì)體的水相內(nèi)核比率，從而逐漸提高了葡萄糖包覆率；當壓力升高到18～20 MPa時，葡萄糖的包覆率為25.7%～27.5%；繼續(xù)增大壓力，體系內(nèi)膠束濃度增大，膠束之間碰撞、融合幾率增加，水相內(nèi)核比率減小，包覆率降低。

2.2 溫度對葡萄糖包覆率的影響

實驗壓力20 MPa下，溫度分別為30、35、45、55和65 ℃下制備脂質(zhì)體，圖3給出了脂質(zhì)體包覆率隨溫度的變化曲線。隨溫度的增加，脂質(zhì)體對物葡萄糖的包覆率顯著增加，最高可到41.3 %。當溫度升高時體系內(nèi)分子熱運動加劇，脂質(zhì)體雙分子層流動性增強，體積大的易破裂形成體積小的脂質(zhì)體以維持體系的相對穩(wěn)定性，這樣體系內(nèi)脂質(zhì)體體積平均粒徑不斷減小，同時膠束濃度增加，這種變化相當于增加了脂質(zhì)體水相內(nèi)核的比率，因而有更多的藥物進入到脂質(zhì)體內(nèi)部，從而表現(xiàn)為包覆率隨溫度的增加而逐漸增加。當然，考慮到溫度過高，對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性、有效性不利，一般實驗都選擇在 55～60 ℃進行研究。

圖3 葡萄糖包覆率隨溫度變化曲線

2.3 平衡時間對葡萄糖包覆率的影響

實驗壓力20 MPa、溫度55 ℃時，平衡時間分別為15、20、30、40、45、50和55 min下制備脂質(zhì)體，圖4給出了脂質(zhì)體包覆率隨平衡時間的變化曲線。

當反應(yīng)平衡時間由15 min增加到45 min時，制得的葡萄糖脂質(zhì)體包覆率逐漸增加，最高可到26.6%；但繼續(xù)增加平衡時間，脂質(zhì)體包覆率反而逐漸下降。原因在于實驗制備的脂質(zhì)體膠束溶液在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定體系，存在較大自由能，脂質(zhì)體雙分子層分子間作用力較弱，隨時間的延長，表面張力明顯減弱，雙分子層流動性增強，因此易于發(fā)生滲漏，導(dǎo)致包覆率大幅度下降。

圖4 葡萄糖包覆率隨平衡時間變化曲線

2.4 乙醇與類脂質(zhì)量比對包覆率的影響

在壓力為20 MPa，乙醇與類脂用量比分別為0.5:1、1.5:1、2:1、2.5:1 和 3:1 條件下制備脂質(zhì)體，圖5反映了脂質(zhì)體包覆率隨類脂與乙醇用量比變化關(guān)系。

圖5 包覆率隨乙醇與類脂質(zhì)量比變化曲線

由圖5可見，反應(yīng)釜內(nèi)壓力保持20 MPa，乙醇與類脂質(zhì)量比為0.5:1～2:1時，隨著乙醇用量的增加，脂質(zhì)體對葡萄糖包覆率會逐漸增加；當乙醇與類脂質(zhì)量比為2:1～3:1時，包覆率逐漸減小。

大豆卵磷脂分散在水溶液中形成膠束，醇分子能穿入膠束形成混合膠束，減小膠束之間的排斥力，同時由于醇分子的加入使體系的熵值增大，所以有利于膠束的形成和增大，這樣在宏觀上表現(xiàn)為包覆率的增加。當加入的醇超過臨界值時，體系內(nèi)的膠束濃度也增加到一個臨界值，繼續(xù)增加醇的用量使膠束濃度增加，膠束間相互碰撞交聯(lián)融合的幾率增加，原有包覆在水相內(nèi)核中的親水性藥物將會滲漏出來，從而使包覆率逐漸降低。

2.5 不同工藝制備的葡萄糖脂質(zhì)體體積平均粒徑

薄膜分散法制備的脂質(zhì)體粒徑分布如圖6所示，體積平均粒徑為308 nm。葡萄糖的包覆率僅有9.5%。

圖6 薄膜分散法制備脂質(zhì)體粒子粒徑分布

超臨界逆向蒸發(fā)法（溫度55 ℃、壓力20 MPa、平衡時間35 min、乙醇與類脂質(zhì)量比2:1）制備的脂質(zhì)體粒徑分布如圖7所示，體積平均粒徑為320 nm。

圖7 超臨界工藝制備脂質(zhì)體粒子粒徑分布

評價脂質(zhì)體質(zhì)量的指標主要有外觀、粒徑分布和包覆率等。其中包覆率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)在質(zhì)量的一個重要指標。比較兩種制備方法，采用超臨界流體技術(shù)能夠顯著提高脂質(zhì)體對葡萄糖的包覆率，脂質(zhì)體粒徑分布窄、體積平均粒徑小。

3 結(jié)論

用超臨界逆相蒸發(fā)法制備的葡萄糖脂質(zhì)體平均粒徑320 nm左右，包覆率最高可達41.3%。

實驗操作參數(shù)壓力、溫度、平衡時間和乙醇與類脂用量比對脂質(zhì)體藥物包覆率影響很大：壓力為10～20 MPa時，葡萄糖脂質(zhì)體包覆率逐漸增加，達到25.7%～27.5%，隨后包覆率逐漸減小；溫度為 35～65 ℃時，包覆率顯著增大，最高可達41.3%；平衡時間為15～45 min時，包覆率顯著增加，但超過45 min后對脂質(zhì)體包覆率是極其不利的；乙醇與類脂質(zhì)量比為0.5:1～2:1時，脂質(zhì)體對葡萄糖包覆率逐漸增加，當質(zhì)量比在2:1～3:1時，包覆率是逐漸減小的。

[1]NAGAYASU A, UCHIYAMA K. The size of liposomes:a factor which affects their targeting efficiency to tumors and therapeutic activity of liposomal antitumor drugs [J].Advanced Drug Delivery Reviews, 1999, 40(1-2): 75-87.

[2]孫聚魁, 鄧英杰, 曹金娜. 納米脂質(zhì)體研究進展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2010, 27(12): 993-997,1002.

[3]ZUZANNA D K, AGATA D J. Liposomes as delivery systems for antibiotics [J]. International Journal of Pharmaceutics, 2010, 387(1-2): 187-198.

[4]劉曉謙, 王錦玉, 仝燕, 等. 脂質(zhì)體制備技術(shù)及其研究進展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2011, 46(14): 1084-1088.

[5]張自強, 朱家壁, 姚靜, 等. pH 梯度法制備伊立替康脂質(zhì)體[J]. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2008, 39(4): 312-316.

[6]程曉丹, 李學(xué)明, 顧立. 脂質(zhì)體對水溶性藥物包封方法的研究進展[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2009, 24(2):194-197.

[7]KATSUTO O, TOMOHIRO I. Development of a new preparation method of liposomes using supercritical carbon dioxide [J]. Langmuir, 2001, 17: 3898-3901.

[8]TOMOHIRO I, KATSUTO O. Preparation and physicochemical properties of various soybean lecithin liposomes using supercritical reverse phase evaporation method [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,2003, 27: 133-140.

[9]KATSUTO O, TAKESHI S. Preparation of liposomes using an improved supercritical reverse phase evaporation method [J]. Langmuir, 2006, 22: 2543-2550.

[10]謝芳. 超臨界技術(shù)制備低水溶性藥物脂質(zhì)體實驗研究[D]. 大連理工大學(xué), 2009.

[11]陳召紅, 劉皈陽, 魏亞超. 脂質(zhì)體包封率測定方法研究進展[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2011, 27(1): 79-82.