重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白異構(gòu)體鑒定

劉 巍，范 開

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(簡(jiǎn)稱TNHH)系由大腸桿菌重組表達(dá)，經(jīng)純化精制而得的具有國(guó)內(nèi)外創(chuàng)新性研究成果的注射藥物。應(yīng)用該工藝制備的TNHH理論氨基酸數(shù)為283個(gè)，理論相對(duì)分子質(zhì)量為31525.5 D，理論等電點(diǎn)(PI)為4.57。由TNHH的氨基酸序列可知，在其結(jié)構(gòu)中含有10個(gè)半胱氨酸，形成5對(duì)二硫鍵，因此，在制備工藝中存在因二硫鍵錯(cuò)配而形成的異構(gòu)體。為了進(jìn)一步去除異構(gòu)體，本研究采用適宜的質(zhì)控方法(RP-HPLC法、等電聚焦、非還原型SDS-PAGE凝膠電泳法、非變性PAGE法、活性分析、陰離子交換HPLC分析異構(gòu)體)對(duì)異構(gòu)體鑒定和含量比例進(jìn)行控制。首先制備TNHH異構(gòu)體并進(jìn)行分析鑒定，在此基礎(chǔ)建立一種質(zhì)控方法分析并測(cè)定本品中異構(gòu)體的最低限量，以達(dá)到TNHH中異構(gòu)體含量不高于5.0%的國(guó)家生物藥物異構(gòu)體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Amersham Bioscience純化儀(美國(guó)GE);Waters 600-2487系統(tǒng)液相色譜儀(美國(guó)Waters);Bio-Rad Universal電泳儀(美國(guó)Bio-Rad);Source 30Q預(yù)裝柱(美國(guó) GE);PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm(美國(guó)Polymer Laboratories);SourceTM15Q，10×50 mm，15 μm(美國(guó) Pharmacia);TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)(北京普析);Spectra Max190酶標(biāo)儀(美國(guó)MD);HHS-4S型電子恒溫水浴鍋(上海南陽(yáng));冷凍干燥機(jī)(Labconco);PHS-3C型PH計(jì)(上海大普);透析袋(Green Bird)。

1.2 材料

磷酸氫二鈉(AR，上海生工);磷酸二氫鈉(AR，上海生工);硫酸銨(AR，上海生工);乙酸鈉(AR，上海生工);冰乙酸(AR，廣東光華);乙腈(AR，廣東光華);三氟已酸(AR，廣東光華);蛋白Marker(北京天恩);凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);纖維蛋白原純品(美國(guó)Sigma)。

2 方法

2.1 TNHH異構(gòu)體的制備

采用原液制備工藝路線中Source 30Q層析分離TNHH不同異構(gòu)體。試劑配制:A液為20 mM PB，0.2M(NH4)2SO4，pH 值為 8.0;B 液為 20 mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH 值為 8.0。設(shè)備:Amersham Bioscience純化儀、Source 30Q預(yù)裝柱。經(jīng)復(fù)性和初純化的樣品，用A液平衡Source 30Q預(yù)裝柱，樣品電導(dǎo)稀釋至25.0 mS/cm后上樣，上完樣后用A液平衡至基線;先用25%的B液洗脫TNHH，再用35%的B液洗脫異構(gòu)體。將異構(gòu)體組分對(duì)20倍體積的超純水透析過(guò)夜，再用HPLC法測(cè)體積百分含量，按1.0 mg/支分裝，凍干。

2.2 異構(gòu)體的分析鑒定

2.2.1 RP-HPLC 法

具體操作按2005年版中國(guó)藥典三部附錄ⅢB“高效液相色譜法”［1］。儀器:Waters 600-2487 系統(tǒng)。色譜柱:WATERS symmetry 300TMC45μm，4.6×250 mm;色譜條件:流動(dòng)相的A液為 5%乙腈+0.1%三氟已酸，B液為95%乙腈+0.1%三氟已酸;梯度為線性梯度30 min，B從0～100%;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為 20 μL。將 1.0 mg/mL 的 TNHH對(duì)照品、異構(gòu)體以及兩者混合樣品進(jìn)行RP-HPLC分析［2］。

2.2.2 等電聚焦分析

具體操作按2005年版中國(guó)藥典三部附錄IV D“等電聚焦電泳法”進(jìn)行［1］。儀器:Bio-Rad Universal。電泳儀樣品制備:TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體凍干粉用超純水溶解至1.0 mg/mL。等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品:取1支標(biāo)準(zhǔn)品用0.1 mL超純水溶解，分別取20 μL 上樣［3］。

2.2.3 非還原型SDS-PAGE凝膠電泳法

具體操作依照中國(guó)藥典(2005年版三部)附錄IV C“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”測(cè)定［1］。樣品處理:取TNHH原液和TNHH異構(gòu)體樣品用超純水稀釋至濃度為1.0 mg/mL，按體積3:1的比例加入非還原型樣品緩沖溶液，混勻，100℃水浴5 min，上樣 10 μL［4］。

2.2.4 非變性PAGE電泳

具體操作依照中國(guó)藥典(2005年版三部)附錄 IV C“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”［1］。不同之處:電泳凝膠、電極緩沖液、樣品緩沖液都不帶SDS，即為非變性 PAGE 電泳［5］。樣品處理:取TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體用超純水分別稀釋至濃度為1.0 mg/mL，取 100 μL 加入 25 μL 的 5 × 非變性樣品緩沖液，混勻后直接取10 μL上樣。

2.2.5 活性分析

1)抗凝血酶凝固活性測(cè)定法

依照中國(guó)藥典(2005年版三部)附錄Ⅹ F“抗凝血酶凝固活性測(cè)定方法”進(jìn)行“TNHH抗凝血酶凝固活性測(cè)定方法”［1，6］。取TNHH 和異構(gòu)體各一支配成相同濃度(0 ～ 32.0 μg/mL)，測(cè)定抗2.0 Iu/mL凝血酶的纖維蛋白原凝固時(shí)間。

2)抑制白細(xì)胞粘附活性測(cè)定(細(xì)胞法)

依照中國(guó)藥典(2005年版三部)附錄Ⅹ F“抑制白細(xì)胞粘附活性測(cè)定(細(xì)胞法)”進(jìn)行“TNHH抑制白細(xì)胞活性測(cè)定方法”［1，6］。取TNHH 對(duì)照和異構(gòu)體各 1 支(1 mg/支)配成 5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.038 μg/mL 和空白對(duì)照，測(cè)定抑制人外周血白細(xì)胞粘附活性。

2.3 TNNH原液中異構(gòu)體定量檢測(cè)

采用RP-HPLC法、等電聚焦、非還原型SDSPAGE凝膠電泳法、非變性PAGE法、活性分析等鑒定方法只能對(duì)TNNH異構(gòu)體進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)［3］。根據(jù)TNHH異構(gòu)體與TNHH的等電點(diǎn)差異，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，采用陰離子HPLC來(lái)研究和建立本品TNHH中異構(gòu)體的百分含量［7］。

2.3.1 色譜方法用不同pH值的分離效果

1)樣品制備

取TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體各一支用DDW溶解成1.0 mg/mL，等體積混合后分進(jìn)樣20 μL。主要試驗(yàn)條件:儀器為Waters 600-2487系統(tǒng);色譜柱為 PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm;試劑為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、冰醋酸、氯化鈉。

2)試驗(yàn)方法

方法1 流動(dòng)相A液:20 mM乙酸鈉，pH值為6.0，0.2M 氯化鈉;流動(dòng)相 B 液:20 mM 乙酸鈉，pH值為6.0，0.6 M氯化鈉。梯度:20 min線性梯度，B液從0～100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，柱溫為室溫。

方法2 流動(dòng)相A液:20 mM PB，pH值為8.0，0.2M 氯化鈉;流動(dòng)相 B 液:20mM PB，pH 值為8.0，0.6M 氯化鈉。梯度:20 min線性梯度，B液從0～100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為 214 nm，柱溫為室溫。

2.3.2 色譜方法用不同鹽離子的分離效果(基于不同pH值的分離效果)

1)樣品制備

取TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體各1支用DDW溶解成1.0 mg/mL，等體積混合后分進(jìn)樣20 μL。主要試驗(yàn)條件:儀器WEI Waters 600-2487系統(tǒng);色譜柱 WEI PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm;試劑為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉 、冰醋酸、氯化鈉。

2)試驗(yàn)方法

方法3 流動(dòng)相A液:20 mM乙酸鈉，pH值為6.0，0.1 M 硫酸銨;流動(dòng)相 B 液:20 mM 乙酸鈉，pH值為6.0;0.5 M硫酸銨。梯度為20 min線性梯度，B液從0～100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，柱溫為室溫。

2.3.3 色譜方法用不同色譜柱分析(基于不同鹽離子的分離效果)

1)樣品制備

取TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體各1支用雙蒸水溶解成1.0 mg/mL，等體積混合后分進(jìn)樣20 μL。分別用2根不同的色譜柱試驗(yàn)［8］。儀器為 Waters 600-2487系統(tǒng)。色譜柱 A為 PL-SAX 1000A，8 μm，150×4.6 mm。色譜柱 B為 SourceTM15Q(Pharmacia產(chǎn)品)，10 ×50 mm，15 μm。試劑為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、冰醋酸、氯化鈉。

2)試驗(yàn)方法

流動(dòng)相 A液:20 mM乙酸鈉，pH值為6.0，0.1M硫酸銨;流動(dòng)相B液:20 mM乙酸鈉，pH值為6.0，0.4 M 硫酸銨。梯度為20 min線性梯度，B液從0～100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為 214 nm，柱溫為室溫。

2.3.4 TNHH異構(gòu)體檢出限分析(基于不同色譜柱分析)

1)TNHH異構(gòu)體檢出限分析樣品的配制

取1.0 mg/mL的異構(gòu)體，按5.0%的質(zhì)量比加入1.0 mg/mL的TNHH對(duì)照品中，即含異構(gòu)體的量為5.0%。進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖。結(jié)果計(jì)算:用峰面積歸一化法計(jì)算異構(gòu)體占總面積的百分率。色譜柱為 PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm。儀器為Waters 600-2487系統(tǒng)。試劑為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、冰醋酸、氯化鈉。

2)試驗(yàn)方法

流動(dòng)相A 液:20 mM 乙酸鈉，pH 值為6.0，0.1 M硫酸銨;流動(dòng)相B液:20 mM乙酸鈉，pH值為6.0，0.4 M硫酸銨。梯度為20 min線性梯度，B液從0～100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為 214 nm，柱溫為室溫。

3 結(jié)果與討論

3.1 RP-HPLC 法

從圖1～3可看出，在 RP-HPLC色譜圖上TNHH與其異構(gòu)體不能分離，保留時(shí)間一致。

圖1 TNHH對(duì)照品

圖2 TNHH異構(gòu)體

圖3 TNHH對(duì)照品+異構(gòu)體

3.2 等電聚焦分析

從圖4等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果得知異構(gòu)體比TNHH等電點(diǎn)低0.5左右，二者能有效分離。

圖4 TNHH和異構(gòu)體樣品等電聚焦電泳結(jié)果

3.3 非還原型SDS-PAGE凝膠電泳法

從圖5結(jié)果得知TNHH和異構(gòu)體二者在非還原SDS-PAGE上的遷移率一致，該方法不能鑒別樣品中是否含有異構(gòu)體。

圖5 TNHH和異構(gòu)體樣品非還原型SDS-PAGE電泳結(jié)果

3.4 非變性PAGE電泳

由于本品屬于酸性蛋白，可應(yīng)用不含SDS的非變性電泳進(jìn)行分析。從圖6電泳結(jié)果可知，TNNH與異構(gòu)體均呈單一條帶，TNHH遷移率約慢于異構(gòu)體。異構(gòu)體在非變性PAGE電泳中的遷移率不同于TNHH，與其二、三級(jí)構(gòu)象有關(guān)［4］。

3.5 活性分析

3.5.1 抗凝血酶凝固活性測(cè)定法

根據(jù)表1、2的數(shù)據(jù)，通過(guò)活性計(jì)算公式得到異構(gòu)體抗凝血酶凝固活性為142 ATU/mg，TNHH對(duì)照品抗凝血酶凝固活性為465 ATU/mg，異構(gòu)體比TNHH活性低70%。該方法不能鑒定TNHH和其異構(gòu)體。

圖6 TNHH和異構(gòu)體樣品非變性PAGE電泳結(jié)果

表1 凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品纖維蛋白原凝固時(shí)間 s

3.5.2 抑制白細(xì)胞粘附活性測(cè)定(細(xì)胞法)

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)，由IC50計(jì)算公式可知TNHH活性抑制白細(xì)胞活性IC50為156 ng/mL，異構(gòu)體抑制白細(xì)胞活性IC50為370 ng/mL。TNHH異構(gòu)體活性比TNHH活性約低50%。

表2 TNHH對(duì)照品和異構(gòu)體抗凝血酶凝固時(shí)間 s

表3 TNHH和TNHH異構(gòu)體抑制白細(xì)胞粘附活性吸光度

3.6 TNNH原液中異構(gòu)體定量檢測(cè)

3.6.1 不同pH值的分離效果

試驗(yàn)結(jié)果見圖7、8和表4。從表4可知，流動(dòng)相在pH值為6.0(即方法1)時(shí)，分離度略好于pH值為8.0(即方法2)時(shí)。

3.6.2 不同鹽離子的分離效果

試驗(yàn)結(jié)果見圖9和表5。從表5可知，硫酸銨(即方法3)的分離結(jié)果優(yōu)于氯化鈉(方法1)。因此，在方法3的基礎(chǔ)上，用不同的色譜柱做進(jìn)一步分析。

圖7 方法1(低pH值)色譜圖

圖8 方法2(高pH值)色譜圖

表4 不同pH值的分離效果結(jié)果分析

圖9 方法3的色譜圖

表5 不同鹽離子的分離效果結(jié)果分析

3.6.3 不同色譜柱的分析效果

試驗(yàn)結(jié)果見圖10、11和表6。從表6可知，通過(guò)降低B液中鹽濃度(0.4 M硫酸胺)，異構(gòu)體與TNHH的分離度提至大于1.5。在相同條件下PLSAX的分離度略優(yōu)于 SourceTM15Q。經(jīng)以上研究證明，在pH值為6.0的乙酸-乙酸鈉和含不同梯度硫酸胺的流動(dòng)相中兩者分離度較理想。在色譜柱的選用上，PLX-SAX的分離度略優(yōu)于SourceTM15Q，故選擇PLA-SAX柱。

圖10 PL-SA色譜圖

圖11 SourceTM15Q色譜圖

表6 不同色譜柱的分析效果結(jié)果分析

3.6.4 TNHH異構(gòu)體檢出限分析

試驗(yàn)結(jié)果見圖12及表7。從圖7數(shù)據(jù)可知，經(jīng)方法驗(yàn)證，應(yīng)用該方法和色譜條件能有效檢測(cè)出本品中含有5.0%以下的異構(gòu)體。

圖12 PL-SAX色譜圖

表7 PL-SAX色譜圖分析結(jié)果

4 結(jié)束語(yǔ)

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，在RP-HPLC法、等電聚焦、非還原型SDS-PAGE凝膠電泳法、非變性PAGE法、活性分析等方法中，只有等電聚焦和非還原型SDS-PAGE凝膠電泳法能分辨TNHH和異構(gòu)體，可作為檢定方法進(jìn)行定性鑒定。而采用陰離子HPLC(PL-SAX色譜柱)法能對(duì)TNHH異構(gòu)體進(jìn)行百分含量定量鑒定，可作為檢定方法進(jìn)行定量鑒定。以上指標(biāo)均達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版三部和《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，可對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行有效和可靠的質(zhì)量控制，確保產(chǎn)品安全，并用于TNHH產(chǎn)品異構(gòu)體檢定。

［1］國(guó)家藥典委委員.中國(guó)人民共和國(guó)藥典:三部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

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