桑黃漆酶的發酵條件研究初報*

雷 萍，吳亞召，張飛龍，張文雋，董艷鶴，王成章，宮 坤

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西安市生漆研究所，陜西 西安 710061）

漆酶（Laccases） 是一種結合多個銅離子的蛋白質，屬于銅藍氧化酶，該酶最早是在漆樹的汁液中發現的，故將其命名為漆酶；此后在多種植物、高等真菌[1]、少數細菌及昆蟲體內均有發現[2]。漆酶可存活于空氣中，發生反應后唯一的產物就是水，因此本質上是一種環保型酵素。由于這幾年環保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶也成為眾多學者的研究對象。

漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應用，作為高效的生物檢測器而成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有效工具和手段，在生物制漿、生物漂白、以及有毒化合物的降解等方面具有潛在應用價值，因而引起人們越來越多的研究興趣，成為環境保護用酶研究的熱點[3]。近年來，人們對漆酶的研究越來越深入，其應用的范圍也越來越廣泛。

漆酶屬于藍-銅族氧化酶，其活性中心由4個銅原子組成，在氧化還原反應中起著決定作用。漆酶的Ⅰ型銅原子和氨基酸殘基結合成為單核中心，是酶表現為明顯的藍色。另外，它還包含Ⅱ型和Ⅲ型銅原子，構成三核中心。Ⅰ型銅原子作為初級電子的接受者，參與分子內的電子傳遞，把電子從底物傳遞到其他銅原子上，然后電子結合于三核位點。該位點進一步把電子傳遞給結合活性中心的第二底物氧分子，使之還原為水，而銅的存在是形成復合體所必需的[4]。它們催化的反應是利用分子氧，產生的副產物只有水，所以又稱漆酶為“生態友善酶”。

盡管漆酶在自然界中廣泛分布，但真正具有較高漆酶產量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分布于擔子菌（Basidiom ycotina）、多孔菌、子囊菌、脈胞菌（Neurospora）、柄孢殼菌和曲霉菌等屬種，其中最主要的是擔子菌亞門的白腐菌真菌，研究也較多[5，6]。但是大部分真菌發酵周期較長，使得工業化生產具有一定的局限性。

本研究室前期通過野外采集分離篩選獲得1株桑黃菌[7]，目前還未見關于桑黃菌產漆酶的相關報道。本試驗對其液體發酵進行了研究，初步篩選出適宜菌絲體生長的液體培養基配方，為進一步開發桑黃菌產品提供了技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桑黃菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室。

1.2 培養基

1.2.1 母種培養基

采用PDA綜合培養基。

1.2.2 碳源測定

基礎培養基：蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1[8]、VB110 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.3氮源測定

基礎培養基葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.4 試驗培養基

將碳源基礎培養基中的葡萄糖分別以蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，進行碳源試驗；將氮源測定基礎培養基中的蛋白胨分別以酵母膏、麥麩、（NH4）2SO4、黃豆粉、尿素代替進行氮源試驗。

1.2.5 優化培養基

試驗以玉米粉（A）、葡萄糖（B）為復合碳源，以麥麩（C）、蛋白胨和酵母膏（D）為復合氮源，采取四因素三水平正交試驗的方法對桑黃菌產酶液體培養基進行優化。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養、發酵

將一級桑黃菌菌種0.5 cm2接種于裝有100 mL培養液的300 mL三角瓶，28℃條件下，旋轉頻率150 r·min-1，28℃搖床培養8 d。

1.3.2 碳源篩選試驗

將桑黃菌在6種不同碳源培養基中培養，每次試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.3 氮源篩選試驗

將桑黃菌在6種不同氮源培養基中培養，每次試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.4 正交試驗篩選最佳培養基配方

取一級桑黃菌菌種0.5 cm2分別接種于9種不同的正交試驗培養基中，在溫度29℃，搖床轉速150 r·min-1條件下培養8 d，每次試驗重復5次，結果取平均值。試驗因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平

1.3.5 粗酶液的制備、漆酶產量測定

發酵液10 mL經4 000 r·min-1、4℃離心15 min，棄去菌絲體，取得的上清液即為粗酶液。將1.0 mmol·L-1愈創木酚和50 mmol·L-1的琥珀酸（pH4.5） 配成緩沖液，取4 mL緩沖液和1 mL粗酶液，混勻，30℃恒溫水浴反應30 min，在465 nm處測定吸光度，以滅活粗酶液和緩沖液作為對照，計算酶產量。酶活性單位（IU）定義：每分鐘氧化1 μmol愈創木酚所需要的酶量[9]。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對產酶量的影響試驗

在碳源基礎培養基中分別加入各種碳源2%，進行碳源的篩選試驗，試驗重復5次，取每次產酶量平均值。結果見表2。

表2 不同碳源對桑黃發酵產漆酶的影響

從表2可以看出，桑黃發酵產漆酶以玉米粉作為碳源效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖等。

2.2 不同氮源對產酶量的影響試驗

在氮源基礎培養基中分別加入各種氮源0.5%，進行氮源的篩選試驗，試驗重復5次，取每次產酶量平均值。結果見表3。

從表3可以看出，桑黃最適發酵用氮源為麥麩，其次是黃豆粉、蛋白胨、（NH4）2SO4等。

2.3 正交試驗優化桑黃發酵產漆酶的培養基結果與直觀分析

正交實驗直觀分析表見表4。

從表4可以看出9個處理中，處理2的產酶量最大7 666 U·L-1。由此得出較優的桑黃發酵生產漆酶培養基配方為玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1。處理6次之，處理3、處理4較差。

表3 不同氮源對桑黃發酵產漆酶的影響

表4 L9(34)正交試驗結果直觀分析表

3 討論

通過試驗發現桑黃菌發酵生產漆酶最適碳源是玉米粉，氮源為麥麩。葡萄糖也可作為發酵碳源，但玉米粉價格低廉，本試驗選擇玉米粉做發酵碳源。

采用正交方法優化出了桑黃菌發酵生產漆酶的培養基配方。結果表明，玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、Cu2+60 μmol·L-1、VB11 mg·100-1·mL-1。

[1]鈔亞鵬，錢世鈞.真菌漆酶及其應用[J].生物工程進展，2001，21（5）：23-28.

[2]Alexandre G,Zhulin IB.Laccases are widespread in bacteria[J].Trends in Biotechnology，2000，18 （2）：41-42.

[3]尹亮，陳章和，趙樹進.白地霉產漆酶條件優化及對偶氮染料的脫色[J].華南理工大學學報：自然科學版，2008，36（12）：85-90.

[4]Faraco V,Giardina P,Palmieri G,et al.Metal-activated laccase promoters[J].Progress in Biotechnology，2002 （21）：105-111.

[5]李兵，王宇光.平菇漆酶與Cu2+調控關系的研究進展[J].安徽農業科學，2008（7）：2660-2661.

[6]趙林果，陸葉，謝慧芳，等.碳源和氮源對彩絨革蓋菌液體發酵合成漆酶的影響[J].微生物學雜志，2007，27（5）：57-60.

[7]雷萍，孫悅迎，張文雋，等.野生桑黃菌種分離與培養特性研究初報[J].食用菌學報，2007，14（2）：71-75.

[8]王麗娟，何培新，李明麗.漆酶高產菌株的篩選及產酶條件優化[J].鄭州輕工業學院學報，2010，25（4）：29-31.

[9]林俊芳，劉志明，陳曉陽，等.真菌漆酶的活性測定方法評價[J].生物加工過程，2009，7（4）：1-8.