5-氮-2’脫氧胞苷對食管癌細胞系KYSE220中CDH13基因甲基化的影響

陳禮忠* 於建鵬

（1 湖北省黃石市河口衛生院，湖北 黃石 435000；2 湖北省黃石市腫瘤醫院，湖北 黃石 435000）

CDH13是一種抑癌基因，位于16q24，它的缺失和腫瘤發生密切相關[1]。已證實在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌中CDH13表達下調[2]。基因甲基化是可逆過程，逆轉抑癌基因甲基化可恢復抑癌基因轉錄水平。5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）是目前常用的甲基化抑制劑，通過抑制DNA甲基化轉移酶（DNMT）來抑制抑癌基因甲基化從而調節細胞分化和基因表達[3]。本研究應用5-Aza- dC干預培養的人食管癌細胞系KYSE220，觀察干預前后CDH13基因啟動子區甲基化狀態及表達水平，為食管癌藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

KYSE220用含47.5?RPMI的1640培養基，加入含5%胎牛血清的47.5% F-12，在37℃，5%CO2的培養液中培養。收取細胞進行實驗，以未加藥物的細胞株作為對照。

1.1.2 試劑和儀器

胎牛血清和RPMI培養基購自GIBCO公司，5-aza-2'-deoxycytidine（Sigma公司），RNA 提取試劑及逆轉錄試劑盒Transzol（北京全式金公司），基因組DNA 提取試劑（takara），EZ DNA Methylation? Kit（Zymo research）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

用含5%胎牛血清的RPMI培養基在37℃，5%CO2，飽和濕度下孵育培養。將細胞以適宜密度接種，加入含5-Aza-CdR的RPMI培養基，使其藥物最終濃度5μmol/L，每24h更換新鮮含藥培養基，藥物濃度同前，連續作用5d后棄去藥液，收取細胞進行實驗，以未加藥物的細胞株作為對照。

1.2.2 DNA提取

用DNAiso Reagent抽提細胞株中高純度基因組DNA。紫外分光光度計測定核酸吸光度（A）值及DNA濃度。

1.2.3 DNA亞硫酸氫鹽修飾

按EZ DNA Methylation? Kit 說明書進行操作。最后獲得10μL TE緩沖液洗脫修飾好的DNA，-20℃保存。

1.2.4 RNA提取、逆轉錄

按全式金公司說明書用Transzol提取細胞RNA。經凝膠電泳后，使用紫外分光光度儀檢測提取的總 RNA 的質量和濃度，要求A260/A280≥2.0，并計算RNA 含量。cDNA的合成反應體系20μL。取Oligo（dT） （0.5 μg /μL） 1μL，每一標本取總RNA 1μg，2×TS Reaction Mix 10μL，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μL，用不含RNAase的水不足至總體積20μL。42℃孵育30 min，85℃加熱5min失活TransScript。

1.2.5 引物設計和合成

引物由北京奧克科公司合成。CDH13上游引物：5'-TTCAGCAGA AAGTGTTCCATAT-3' ；下游引物：5'-GTGCATGGACGAACAGAGT-3'。GAPDH 基因上游引物：5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3'；下游引物：5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。

1.2.6 PCR反應條件

95℃預變性5 min；95℃變性30s，56℃復性30s，72℃延伸30s，共40個循環；72℃ 延伸5 min。RT-PCR產物經2%瓊脂糖膠分離。

1.3 統計學處理

用藥前后比較采用配對t檢驗。Pearson統計方法分析基因甲基化與其表達之間的相關性，采用SPSS 17.0統計軟件包進行處理，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5-Aza-Cd作用前后人食管腺癌KYSE220細胞CDH13基因啟動子甲基化狀態改變

MSP法檢測用藥前后CDH13基因啟動子甲基化狀態，干預前KYSE220細胞呈甲基化狀態，干預后去甲基化，見圖1。

2.2 5-Aza-Cd作用前后人食管腺癌KYSE220細胞CDH13mRNA表達水平

RT-PCR檢測用藥前后CDH13mRNA水平，干預前KYSE220mRNA水平低下，干預后mRNA水平明顯升高，見圖2。

3 討 論

人類腫瘤的發生、發展與DNA甲基化的異常有關，在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特定基因的異常甲基化，某些基因的甲基化可能使癌癥的惡性進展風險增加[4]。CpG島甲基化導致的抑癌基因失活是可逆轉的，利用去甲基化制劑使已經發生甲基化的基因發生去甲基化后可重新表達，恢復抑癌基因功能，可能為臨床治療腫瘤提供新手段。甲基轉移酶DNMT催化DNA甲基化，在CpG島異常甲基化的腫瘤細胞中多呈過表達，該酶已成為DNA去甲基化，恢復抑癌基因功能的靶分子之一[5]。

我們用DNMT抑制劑5-Aza-dC處理食管癌KYSE220細胞后，用RT-PCR方法檢測處理前后CDH13mRNA表達水平，結果表明：5-AzadC處理前，KYSE220細胞CDH13啟動子區高度甲基化，并呈低表達或表達缺失；經過5-Aza-CdR處理后，CDH13啟動子區呈去甲基化，CDH13表達水平明顯提高，二者之間有顯著相關性，提示在CDH13表達缺失的食管癌癌細胞中，CDH13啟動子區甲基化可能導致CDH13表達失活。DNA異常甲基化常出現在腫瘤早期，這為腫瘤早期診斷提供了一定依據。去甲基化制劑5-Aza-dC能有效逆轉CDH13基因甲基化狀態，激活CDH13基因表達，CDH13基因將可能成為食管癌治療的一個新靶點；5-Aza-dC有可能用于食管癌的臨床治療，為食管癌患者診斷和治療提供一個新途徑。

[1]Zhong Y.Loss of H-cadherin protein expression in human nonsmall cell lung cancer is associated with tumorigenicity[J].Clin Cancer Res,2001,7(6)： 1683-1687.

[2]Toyooka KO.Loss of expression and aberrant methylation of the CDH13 (H-cadherin) gene in breast and lung carcinomas[J].Cancer Res,2001,61(11)： 4556-4560.

[3]Kantarjian H.Results of a randomized study of 3 schedules of lowdose decitabine in higher-risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia[J].Blood,2007,109(1)： 52-57.

[4]Jin Z.Hypermethylation of the nel-like 1 gene is a common and early event and is associated with poor prognosis in earlystage esophageal adenocarcinoma[J].Oncogene,2007,26(43)：6332-6340.

[5]Ghoshal K,Bai S.DNA methyltransferases as targets for cancer therapy[J].Drugs Today (Barc),2007,43(6)： 395-422.