仿生法評定幾種豬常用植物性飼料原料磷體外透析率

莊曉峰 陳 亮 張宏福 趙 峰 盧慶萍 薩仁娜 李東衛 何科林

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

作為一種非再生資源，磷在飼料工業中具有舉足輕重的地位，是繼蛋白質和能量之外的第3昂貴的飼料原料[1-4]。生產上為避免動物磷營養缺乏，往往向飼料中添加大量無機磷酸鹽，既增加了飼料成本，也導致磷的過量排泄和對環境的嚴重污染[5-8]。因此，準確評定飼料磷的生物學效價對減少磷資源浪費、降低環境污染等都具有重要意義。體內法評定飼料磷生物學效價的結果雖然客觀可靠，但耗時、耗力、耗資，且條件難以控制、重復性差[9]，很難滿足實際需求。而體外法由于快速、簡便、費用低等優點，越來越受到營養學家的關注。迄今，體外法評定飼料磷透析率的方法有試管法和透析管法。試管法由于密閉酶促反應環境中消化產物對酶促反應的抑制而遭病詬;透析管法則常將試管等容器中模擬胃的消化產物轉入透析袋中進行小腸段模擬[10-14]，胃和小腸階段之間涉及樣品的轉移過程，增加了試驗誤差。針對傳統的體外消化法，動物營養學國家重點實驗室開發出了單胃動物仿生消化系統，克服了傳統體外消化法在消化過程中無法實現產物實時分離的缺陷，使用實時動態的消化產物分離技術，通過計算機自動控制體外消化過程，基本排除了由于人工操作引入的系統誤差，提高了試驗結果的重演性[15-16]。本試驗利用SDS-Ⅰ型仿生消化系統，參考Liu等[11]測定飼料磷體外透析率的操作，在前期關于不同截留分子質量(MWCO)透析袋對仿生消化法評定飼料總磷體外透析率影響研究的基礎上[17]，探討消化殘渣總磷測定法和透析液無機磷測定法評定飼料原料磷體外透析率的可行性，為確立仿生消化法評定豬飼料磷體外透析率的適宜操作規程提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用玉米、豆粕、菜籽粕、麥麩、米糠5種豬常用飼料原料，其磷含量如表1所示，用四分法取樣后粉碎過40目篩，-20℃儲存備用。MWCO為14 000和3 500 u的透析袋購自北京經科宏達生物技術有限公司(美國Viskase公司進口分裝)。

表1 飼料原料的磷含量(干物質基礎)Table1 Phosphorus content of feed ingredients(DM basis) %

1.2 試驗設計

試驗1參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的操作，選用美國ViskasMWCO為14 000和3 500 u的透析袋進行試驗，仿生消化結束后分別測定玉米、豆粕、麥麩消化殘渣中總磷及透析液中無機磷含量，每個樣品4個重復。

試驗2參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的操作，選用美國ViskasMWCO為14 000和3 500 u的透析袋，通過測定仿生消化透析液中的無機磷含量，評定玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩的磷體外透析率，每個樣品4個重復。

1.3 透析袋的處理

1.4 透析液的配制

在39℃下配制pH 6.44的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作為小腸階段透析液，每瓶透析液體積精確為1 L，并加入160×104U青霉素鉀防止微生物的生長。

1.5 仿生消化系統操作過程

仿生消化時間及操作方法參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的試驗，胃和小腸段消化時間分別設置為75和240 min。具體操作為:準確稱取1.000 0 g飼料原料(精確至0.000 2 g)于10 mL玻璃試管中，同時測定干物質含量，用20 mL模擬胃液(含1 475.0 U/mL胃蛋白酶)將飼料樣品完全轉移至裝好透析袋的仿生消化管中。把消化管置于仿生消化系統中，開始試驗。胃階段消化結束后，用加酶器在每個消化管中分別加入2 mL NaHCO3溶液(調節pH為6.44)及2 mL豬模擬小腸液，使食糜中含69.10 U/mL胰蛋白酶(Amresco)、8.68 U/mL糜蛋白酶(Amresco)、221.43 U/mL淀粉酶(Sigma)，然后接通透析液管道，讓小腸段透析液循環流過仿生消化管，每排5個消化管的透析液作為1個重復。待樣品消化結束后，準確移取10 mL緩沖溶液瓶中的透析液于50 mL容量瓶中，采用鉬黃比色法測定其中無機磷含量[18]，計算透析液中無機磷總量。同時用去離子水將透析袋中的消化液和殘渣無損失的轉移至150 mL的燒杯中，65℃條件下烘至無水痕后，測定殘渣總磷含量[18]。

1.6 數據處理

數據用SAS 8.0的MEANS模塊對基本統計量進行分析，按平均值±標準差表示;并對不同處理條件下測定結果進行成組法t檢驗或配對法t檢驗。其中數據計算公式如下:

消化殘渣總磷測定法測得飼料總磷體外透析率(%)=100×[1-P3/(M0×DM0×P1)];

透析液無機磷測定法測得飼料磷體外透析率(%)=100×[P2/(M0×DM0×P1)]。

式中:M0為飼料樣品重(g);DM0為飼料樣品干物質含量(%);P1為飼料樣品總磷含量(%，絕干基礎);P2為透析液中無機磷含量(g);P3為消化殘渣總磷含量(g)。

2 結果

2.1 不同MWCO透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機磷和有機磷比率

由表2和表3可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩總磷體外透析率分別為42.91%、48.41%和86.13%，有機磷比率分別為58.56%、61.74%和7.33%。MWCO 3 500 u透析袋條件下測得飼料原料總磷體外透析率分別為17.23%、28.04%和78.24%，有機磷比率分別為27.22%、50.11%和 1.46%，相比 MWCO 14 000 u透析袋條件下有機磷透過量已降低，但仍然沒有將有機磷完全截留，沒有達到無機磷與有機磷的有效分離。

表2 MWCO 14 000 u透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機磷和有機磷比率Table2 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

表3 MWCO 3 500 u透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機磷和有機磷比率Table3 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 3 500 u dialysis tubings %

2.2 不同MWCO透析袋條件下透析液無機磷測定法測得飼料原料磷體外透析率

由表4可知，不同MWCO透析袋條件下，透析液無機磷測定法測得飼料原料磷體外透析率存在顯著差異(P＜0.05)。MWCO 14 000 u透析袋測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩磷的體外透析率分別為17.78%、18.52%、34.77%、14.09%、79.82%，顯著高于MWCO 3 500 u透析袋測得結果(P＜0.05)，分別提高5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。飼料中的無機磷分子質量極小，分析本試驗結果認為，不同MWCO透析袋條件下飼料原料有機磷的降解率存在差異。

表4 不同MWCO透析袋條件下透析液無機磷測定法測得飼料原料磷體外透析率Table4 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using different MWCO dialysis tubings %

2.3 仿生消化法測定豬飼料原料磷體外透析率的精度

由表5可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下，透析液無機磷測定法測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩的磷體外透析率分別為(17.78±0.28)%、(18.52±0.32)%、(34.77±0.55)%、(14.09±0.45)%、(79.82±0.69)%，重復間最大絕對偏差分別為 0.60%、0.79%、1.24%、0.88%、1.42%，變異系數為 1.56%、1.74%、1.59% 、3.22% 、0.86% 。

表5 MWCO 14 000 u透析袋條件下透析液無機磷測定法測得飼料原料磷體外透析率Table5 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

由表6可知，本試驗測定飼料磷體外透析率的變異系數均控制在4%以內，低于Liu等[19]、方熱軍[12]的體外試驗及賈剛等[20]的體內試驗測定結果的變異系數。從本試驗結果可知，與傳統體外消化試驗及體內試驗相比，在SDS-Ⅰ型仿生消化系統上評定飼料磷體外透析率具有較好的試驗精度。

表6 不同研究者測定飼料磷體外透析率的變異系數的比較Table6 The coefficient of variation of phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by different researchers %

3 討論

3.1 消化殘渣總磷測定法評定豬飼料原料磷體外透析率的可行性

植物性飼料中的磷以無機磷和有機磷(主要是植酸磷)2種形式存在。以無機鹽形式存在的磷在消化道溶解后可直接被動物吸收利用，而以有機化合物形式存在的磷必須經酶水解釋放出無機磷后才能被動物吸收利用[21]，因此，消化殘渣總磷測定法評定飼料磷體外透析率的可行性取決于是否存在透析袋可將飼料中有機磷完全截留。前期關于不同透析袋對仿生消化法評定豬飼料干物質和磷體外透析率影響的研究表明，美國ViskasMWCO 3 500 u透析袋條件下，消化殘渣總磷測定法測得飼料磷體外透析率最低且最接近報道的體內結果[17]。本試驗通過測定飼料消化殘渣中總磷含量及透析液中無機磷含量，對MWCO 3 500 u透析袋分離無機磷與有機磷的有效性進行研究。

MWCO 3 500 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩總磷透析率分別為17.23%、28.04%、78.24%，顯著低于MWCO 14 000 u透析袋條件下測定結果，分別降低25.68%、20.37%、7.89%。透析袋MWCO降低，仿生消化透析液中無機磷和有機磷透析量均有所下降，但從無機磷和有機磷所占比例可以看出，有機磷透析量的降低對飼料總磷透析率的降低起了主要作用。MWCO 3 500 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩透析液中有機磷比率分別為27.22%、50.11%和1.46%，相比14 000 u透析袋條件下有機磷透過量已降低，但是仍有部分有機磷通過透析袋進入到透析液中。MWCO 3 500 u透析袋條件下通過測定消化殘渣總磷含量評定飼料磷體外透析率，會將透析液中的部分有機磷認定為可吸收磷，使測定結果偏高，因此，由于透析袋的限制，消化殘渣總磷測定法并不適用于飼料磷體外透析率的研究。

3.2 不同MWCO透析袋對透析液無機磷測定法評定飼料原料磷體外透析率的影響

迄今，關于飼料磷透析率的體外評定，國內外動物營養學家都有諸多報道。大多數研究者選用MWCO 12 000～14 000 u的透析袋，通過測定透析液中無機磷含量評定飼料磷體外透析率，但關于透析袋孔徑是否對飼料磷透析率存在影響尚未見報道。本試驗選用MWCO 14 000和3 500 u的透析袋，利用仿生消化系統評定了5種豬常用飼料原料磷體外透析率。

從本試驗結果可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩磷的透析率均顯著高于MWCO 3 500 u透析袋測定結果，分別提高 5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。根據植酸分子結構，其含有12個可解離的質子，這些位點可以與蛋白質、氨基酸、淀粉和脂質等物質上的陽離子基團結合，以植酸復合物的形式存在，而飼料中的無機磷分子質量很小。Newkirk等[22]研究報道植酸酶與植酸結合受到植物組織中其他組分不同程度的阻礙作用。Zyla等[10]報道，非淀粉多糖酶與植酸酶之間存在協同作用，也進一步證明了這個問題。分析本試驗結果認為，MWCO 3 500 u透析袋條件下飼料有機磷的降解率低于MWCO 14 000 u透析袋。其原因是采用MWCO 3 500 u透析袋進行試驗，蛋白質、淀粉等的酶解產物無法及時透析出去，對酶促反應的抑制作用導致蛋白質等降解率降低，從而導致植酸磷無法暴露出來與植酸酶結合，無機磷透析率降低。由于麥麩較高的內源植酸酶活性，本試驗測得其磷體外透析率達到了79.82%，是否存在其他原因還需要進一步的研究。結合本試驗結果，建議透析液無機磷測定法評定飼料磷體外透析率時采用MWCO為14 000 u的透析袋，這也與Zyla 等[10]、方熱軍[12]、左建軍[13]、Liu 等[19]、張鐵鷹[23]的報道一致。

3.3 透析液無機磷測定法評定豬飼料原料磷體外透析率的可行性

關于飼料磷體外透析率的研究，大部分研究者的操作步驟為:飼料樣品與胃蛋白酶鹽酸溶液混合于10 mL試管中，恒溫水浴培養固定時間;胃階段消化結束后，向上述試管中加入固定體積的含有胰蛋白酶的NaHCO3溶液，并轉移至MWCO 12 000～14 000 u的透析袋中于固定體積的緩沖溶液中恒溫透析，結果測定透析液中的無機磷含量計算飼料磷體外透析率。本試驗在仿生消化系統的基礎上對以前研究者的操作稍作改動，胃階段即在透析袋中進行，消化結束后，通過加酶器在透析袋中加入調節pH的NaHCO3溶液及小腸模擬消化酶，有效消除了消化殘渣轉移過程的系統誤差;小腸階段采用循環緩沖溶液進行透析，有效避免了反應體系可能存在的飽和問題。

體外消化試驗是通過模擬動物消化道環境條件來進行，但是消化道中的酶是一個復雜多變的多酶系統，且消化過程受到神經、激素系統的調節，體外條件下難以完全模擬[24]，所以在體外模擬消化試驗上更應注重體外試驗法的精確度、可重復性和可靠性。本試驗測得飼料磷體外透析率的變異系數均控制在4%以內，低于Liu等[19]、方熱軍[12]的體外試驗及賈剛等[20]的體內試驗測定結果的變異系數。由此可得，在SDS-Ⅰ型仿生消化系統上，透析液無機磷測定法能夠實現飼料磷體外透析率的研究。

4 結論

①MWCO 3 500 u透析袋條件下，飼料有機磷仍可通過透析袋進入到透析液中，因此消化殘渣總磷測定法不適宜于飼料磷體外透析率的研究。

②采用透析液無機磷測定法評定飼料磷體外透析率，MWCO 14 000 u透析袋測得結果顯著高于3 500 u透析袋，且試驗精度優于傳統體外方法，因此，MWCO 14 000 u透析袋條件下的透析液無機磷測定法更適宜于飼料磷體外透析率的研究。

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