血管緊張素Ⅱ－1型受體基因多態性與高血壓及血管內皮功能的相關性

張 強 崔天祥 李 莉 楊麗紅 孔 靜 (鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014)

腎素-血管緊張素系統(RAS)對血壓和機體內環境的穩定發揮至關重要的作用。由于RAS的作用均由血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)介導，因此AT1R基因與原發性高血壓(EH)相關性的研究成為近年來的熱點。血管內皮細胞能合成及分泌多種生物活性物質，對維持管壁張力和血流有重要作用。近年來，一些研究證實高血壓存在內皮損傷，而EH患者血管內皮功能的遺傳機制研究國內鮮有報道。本研究擬探討AT1R基因多態性與血管內皮功能在EH發病中的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 EH組 入選鄭州大學第二附屬醫院高血壓門診EH患者82例，男53例，女29例，年齡(62±6)歲，收縮壓(154±12)mmHg，舒張壓(86±10)mmHg，均為漢族，EH 診斷符合1999年中國高血壓防治指南規定的診斷標準。受試者均無血緣關系，且排除繼發性高血壓。

1.1.2 正常血壓組 33例，來自健康體檢人群，男23例，女10例，年齡(60±8)歲，收縮壓(120±14)mmHg，舒張壓(72±10)mmHg，未服用影響血壓的藥物對象間無血緣關系。

1.2 檢測方法

1.2.1 血樣采集 取靜脈血5 ml，其中1 ml離心分離血漿，－15℃保存，待測血漿氧化氮(NO)和內皮素(ET);(2)余血加入2%EDTA抗凝管中，－70℃保存，待提取基因組DNA。

1.2.2 AT1R基因的檢測 (1)DNA的提取:應用杭州VGENG生物技術有限公司生產的血細胞基因組DNA制備試劑盒提取組織DNA。(2)PCR擴增:AT1R引物序列:上游5'-CAC CAT GTT TTG AGG TT-3'，下游5'-CGA GTT TCT GAC ATT GTT C-3'，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。(3)限制性酶切:PCR擴增產物3 μl加入內含10 U dDeI的限制性內切酶反應緩沖液稀釋成20 μl，37℃酶切3 h。(4)電泳分型:酶解產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中電泳30 min后EB染色，紫外燈下觀察結果并照相。

1.2.3 血漿NO、ET的檢測 NO測定采用硝酸還原酶法，ET測定采用放射免疫法。

1.2.4 肱動脈超聲檢查 參照Cvelermajer等〔1〕首創的利用高分辨率超聲檢測肱動脈擴張判斷血管內皮功能的方法。受檢者停用血管擴張劑24 h以上，采用HDI-3000型彩色多普勒超聲診斷儀和7.5 MHz線陣探頭，探查深度4 cm，同步記錄心電圖，仰臥位，右上肢外展45°，掌心向上，以二維超聲成像掃描肱動脈。再以肘上2～15 cm肱動脈為靶動脈，顯示長軸切面，測量舒張末期內徑。每次3個心動周期，取平均值。分別測量每位受試者靜息時、反應性充血、再休息及含服硝酸甘油(NTG)后肱動脈內徑。測定基礎值(D0)后將血壓計袖帶放于肱動脈遠端，充氣加壓至收縮壓上50 mmHg，維持4～5 min放氣，放氣后60～90 s內迅速測量肱動脈內徑(D1)。休息10 min，血管內徑恢復至試驗前狀態后，舌下含服硝酸甘油0.5 mg，3～4 min后再次測量血管內徑(D2)。整個過程保持超聲探頭始終處于固定位置。反應性充血及服用硝酸甘油后血管內徑改變情況以第一次測量基礎值的百分數表示，即(D1或D2-D0)/100%。

1.3 統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行統計分析:計量資料用±s表示，均數比較采用t檢驗;兩組之間頻數分布采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 AT1R基因型檢測結果 瓊脂糖凝膠電泳檢測AT1R基因型見圖1。

2.2 兩組間AT1R基因型頻率及等位基因頻率比較 82例EH患者的基因型AA型70例，AC型9例，CC型3例，基因型頻率分別為85.4%，10.9%和3.7%;A和C的等位基因頻率分別為90.9%和9.1%。33例正常血壓者的基因型AA型31例，AC型2例，CC型0例;基因型頻率分別為94%，6%和0.0%;A和C的等位基因頻率分別為97%和3%。經χ2檢驗兩組間C等位基因頻率有顯著性差異(χ2=0.046，P＜0.05)。

2.3 三組間血漿NO、ET濃度和肱動脈內徑變化 見表1。

表1 三組血漿NO、ET濃度和肱動脈內徑變化比較(±s)

表1 三組血漿NO、ET濃度和肱動脈內徑變化比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與EH組比較:2)P＜0.05

組別 n NO(μmol/L)ET(pg/ml)反應性充血后血管內徑改變(%)含服硝酸甘油后血管內徑改變(%)基礎值(mm)對照組 33 73.98±5.68 51.18±4.83 9.80±2.12 4.6±1.455.0±0.8 EH組 82 66.81±6.861) 56.53±6.111) 7.35±2.031) 4.3±1.09 4.8±0.9 EH具有C等位基因組 12 54.63+5.422) 62.76±5.802) 5.20±1.981)2) 2.9±1.361)2)4.6±0.7

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測AT1R基因型

3 討論

RAS通過AngⅡ調節血壓、體液容量和電解質平衡，而AngⅡ主要通過與靶器官細胞膜上的特異性受體結合發揮生物學效應，人類AT1R基因位于3號染色體長臂21～25區〔2〕，基因組全長47 kb，包含5個外顯子，為單拷貝基因。1994年Bonnardeaux等〔2〕在AT1R的編碼區及3'非翻譯區測到五種多態性，與臨床關系較為密切的基因變異A1166C位于3'未翻譯區(UTR)的5'端，并證實A1166C突變與血壓升高有關。本研究提示AT1R基因A1166C多態性與EH相關，C等位基因是EH的獨立危險因素。

血管內皮不僅是血管屏障，也是重要的內分泌和效應器官，可以產生NO、ET-1和多種血管活性物質以調節血管舒縮功能〔1〕。高血壓可以導致內皮功能障礙，但也有研究顯示內皮功能紊亂早于高血壓的發生〔3〕。本研究結果說明高血壓伴有內皮細胞損傷、血管舒縮功能障礙，主要原因是由于內皮細胞釋放的縮血管物質增多而舒血管物質減少。

Taddei等〔4〕研究發現，即使無明顯的影響血管內皮的危險因素，但內皮仍出現不同程度的功能障礙，由此認為血管內皮功能也與遺傳因素有關。本研究結果說明EH存在血管內皮舒縮功能障礙，表現為血漿NO濃度下降和ET濃度升高，且有一定的遺傳因素參與，AT1R基因1166CC型可能是EH內皮舒縮功能障礙的危險因素。

綜上所述，遺傳因素是EH發病機制中的重要因素，AT1R基因變異是參與EH發病的重要分子基礎，EH可以導致血管內皮舒縮功能障礙。研究AT1R基因A1166C多態性與EH內皮功能障礙的關系可以作為早期判斷高血壓預后的間接指標。

1 Celermajer DS，Sorensen KE，Gooch VM，et al.Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis〔J〕.Lancet，1992;340:1111-5.

2 Bonnardeaux A，Davies E，Jeunemaitre X，et al.Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension〔J〕.Hypertension，1994;24(1):63-9.

3 陳 明，胡申江.高血壓病血管內皮功能障礙及治療〔J〕.心血管病學進展，2005;26:222-6.

4 Taddei S，Virdis A，Mattei P，et al.Defective L-arginine-nitric oxide pathway in offspring of essential hypertensive patient〔J〕.Circulation，1996;94:1298-303.