膽管癌組織中Ezrin蛋白表達水平及其臨床價值

李紹軍 劉小方 (青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院肝膽胰外科，山東 煙臺 264000)

膽管癌或膽管細胞癌是起源于膽道上皮細胞的惡性腫瘤，發病率約占肝膽系統惡性腫瘤的15%〔1～3〕。尋找有效的腫瘤標志物不但可以早期診斷和對預后進行判斷，也對尋找有效治療靶點提供有益的參考。Ezrin蛋白是細胞骨架的主要成員，對腫瘤細胞的作用主要是參與控制細胞的形態、黏附、運動及為細胞的增殖和生存轉換生長信號。近年來發現Ezrin蛋白的過表達與多種腫瘤侵襲與轉移有關〔4～8〕，但在膽管癌中的系統研究尚未見報道。本研究探討膽管癌Ezrin蛋白表達變化以及其與腫瘤分期、轉移的關系，旨在探討Ezrin蛋白在膽管癌發生、發展與轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 煙臺毓璜頂醫院肝膽外科2007年7月至2010年7月收治的有完整資料記載的膽管癌標本38例，排除二次手術，可供使用的標本30例;同時選取10例良性膽管疾病作為對照。所有標本資料詳實，術前都未接受放療與化療。30例膽管癌標本中女12例，男18例;年齡37～74〔平均(57.2±14.7)〕歲;按照2002年美國癌癥聯合委員會(AJCC)公布的膽管癌分期方案，Ⅰ/Ⅱ期者11例，Ⅲ/Ⅳ期者19例;病理證實有淋巴結轉移17例，無淋巴結轉移13例。兔抗人Ezrin單克隆抗體:Bioworld公司;生物素-過氧化物酶復合物(SP)免疫組化染色試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒:福州邁新生物技術有限公司。

1.2 方法 所有標本均術后立即取材，放入4%中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切取4 μm厚度切片1張，用于免疫組織化學染色，按SP免疫組化試劑盒說明書進行。

1.3 結果判定標準 染色細胞內出現棕色顆粒為陽性表達。Ezrin在癌組織中主要在胞質中表達。選取每張病理切片至少10個不同的視野在高倍鏡下(250倍)觀察，以此來判斷細胞染色強度與著色率。染色結果半定量分析:以染色強度結合陽性細胞數百分比綜合計分，組織切片中胞質染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞標志。染色強度以多數細胞呈現的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即某類細胞5個視野(每250倍視野計數100個此類細胞)的陽性細胞平均數:0～5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。每張切片隨機取5個250倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積:0分為陰性(－)，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行χ2檢驗。

2 結果

2.1 Ezrin蛋白在膽管癌組織及良性膽管組織中的表達Ezrin蛋白在膽管癌組織及良性膽管組織中均有不同程度的表達，主要表達以細胞質和細胞膜為主，良性組織中，陽性表達率60.0%(弱陽性5例，強陽性1例)，評價得分3.1。膽管癌陽性表達率90%(弱陽性7例，強陽性20例)，平均得分6.96。經統計分析后發現，膽管癌組織中Ezrin蛋白的表達與良性膽管組織比較有顯著性差異(P＜0.01)。見圖1。

2.2 膽管癌中Ezrin蛋白的表達與臨床病理特征的關系 Ⅰ/Ⅱ期11例膽管癌患者中陽性表達9例(82%，弱陽性5例，強陽性4例)，平均得分4.64;Ⅲ/Ⅳ期19例膽管癌患者中，陽性表達18例(95%，弱陽性2例，強陽性16例)，平均得分8.32，Ezrin蛋白在Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期膽管癌患者中的陽性表達強度有顯著差異(P＜0.05)。17例伴淋巴結轉移的患者Ezrin蛋白陽性表達率94%(弱陽性1例，強陽性15例)，評價得分9.11;沒有轉移的陽性表達率85%(弱陽性6例，強陽性5例)，平均得分4.09，經統計分析差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 Ezrin蛋白在膽管癌中的表達

圖2 Ezrin蛋白表達與臨床分期及淋巴結轉移的關系(×250)

3 討論

在影響影響膽管癌預后幾個因素中最關鍵是腫瘤的浸潤與轉移。膽管癌的侵襲、轉移是多基因參與、多步驟完成的復雜過程，其中腫瘤細胞黏附能力及運動能力的改變，腫瘤細胞與細胞外基質間的相互作用是腫瘤發生侵襲轉移的基礎，也是腫瘤浸潤轉移的關鍵環節〔4，5〕。探討影響這些關鍵環節的調控因素將有助于更深入地理解膽管癌浸潤和轉移的機制。

Ezrin蛋白是一種將細胞骨架與細胞膜連接起來的蛋白質，于1981年首次發現，是埃絲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族的一員〔5，6〕。Ezrin蛋白表達具有相對的組織和細胞特異性，在正常組織主要集中在富含肌動蛋白的細胞表面，在維持細胞形態和生存方面起重要作用。研究發現Ezrin蛋白與腫瘤轉移之間有密切聯系:在乳腺浸潤性導管癌中Ezrin蛋白表達水平也明顯高于良性病變，而且與淋巴結轉移正相關;伴有Ezrin蛋白過表達的卵巢癌細胞具有高轉移潛能，而且預后差。通過siRNA對卵巢癌的Ezrin蛋白進行沉默可以顯著降低腫瘤細胞的侵襲能力;Ezrin蛋白表達水平高的食管癌發生惡性轉移的能力明顯高于Ezrin蛋白表達水平低的腫瘤細胞，而且容易在內臟和軟組織中形成腫瘤團塊〔7～10〕。

在本研究中，膽管癌組織中的Ezrin蛋白表達明顯高于正常膽管組織，說明在膽管癌的發病過程中，Ezrin蛋白發生了表達差異變化。在病理分期表達差異研究中，惡性程度高的Ⅲ/Ⅳ期膽管癌的表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的惡性程度比較低的膽管癌組織，而且發生轉移的膽管癌組織的表達率明顯高于尚未發生轉移的膽管癌組織。說明Ezrin蛋白在膽管癌的惡性變和浸潤轉移過程中具有一定的作用。

本次研究結果說明Ezrin蛋白可作為檢測膽管細胞癌程度、病理分期和預后的重要參考指標。但E-cadherin和Ezrin蛋白在膽管癌發生、惡變以及轉移過程中，是直接作用于腫瘤細胞還是通過其他蛋白質進行作用以及其中的信號通路等研究尚未涉及，有待進一步研究。

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