雷公藤內酯醇對慢性腦缺血模型大鼠海馬突觸素和突觸后致密物95的影響

潘發福 梁明春 劉卉芳 呂 誠 胡小令 萬 斌 楊寶林 聶 菁

(南昌大學醫學院解剖學教研室，江西 南昌 330006)

慢性腦缺血(CCI)所致的免疫炎癥反應可引起神經元變性死亡，損害突觸可塑性，從而構成了CCI導致認知功能損害的重要病理生理基礎〔1〕。突觸素(SYN)是突觸前囊泡上的一種蛋白質，參與神經遞質的釋放，是突觸終末的特異性標記物〔2〕。突觸后致密物95(PSD-95)是突觸后致密物中含量最豐富的骨架蛋白，在突觸后膜受體定位和信號傳導通路中發揮重要的作用。雷公藤提取物雷公藤多甙可以改善CCI大鼠認知功能〔3〕。本實驗通過雙側頸總動脈永久性結扎法(2-VO)建立CCI動物模型，選取突觸相關的兩種蛋白(SYN、PSD-95)作為檢測指標，進一步探討雷公藤多甙的主要成分雷公藤內酯醇對CCI模型大鼠突觸可塑性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 雷公藤內酯醇(純度為99.8%，批號070929，福建省醫學科學研究所，溶于4%丙二醇溶液中);SP試劑盒(Zymed公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉公司);SYN、PSD-95兔抗(北京博奧森生物技術有限公司);PCR擴增用引物(上海生物工程有限公司);2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司);RevertAidTM HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit(Formentas公司);快速恒溫冰凍切片機YD-1508Ⅲ(浙江金華益迪醫療設備廠);Image.Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(Media Cybernetics公司);MG25+基因擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立 取30只4月齡、體重250～275 g的健康雄性SD大鼠(南昌大學實驗動物科學部提供)，隨機分成:對照組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠采用2-VO建立CCI模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，常規碘附消毒，取頸部正中切口，分離出頸總動脈，永久性結扎雙側頸總動脈，確認結扎穩妥后用無菌生理鹽水清洗傷口，檢查傷口，無明顯出血后用1號絲線逐層縫合切口。對照組大鼠暴露雙側頸總動脈后1號絲線從其底部穿過但不結扎，清洗傷口后逐層縫合切口。

1.2.2 實驗動物用藥 術后治療組大鼠每日腹腔注射雷公藤內酯醇0.4 mg/kg，模型組和對照組大鼠每日腹腔注射等容積4%丙二醇溶液，連續注射28 d。

1.2.3 甲苯胺藍尼氏染色和免疫組織化學染色 每組各取5只大鼠，麻醉后行心臟灌注，0.9%生理鹽水沖洗后灌入4%多聚甲醛磷酸緩沖液，取腦組織，外固定后放入30%蔗糖磷酸緩沖液中，完全沉底后留取從前囟后3.3～4.3 mm間的背側海馬作連續冠狀冰凍切片，片厚20 μm，分別行甲苯胺藍尼氏染色和SYN、PSD-95免疫組織化學染色。免疫組織化學染色(SP法):3%H2O2去離子水，孵育10 min;正常山羊封閉血清室溫孵育20 min，傾去;分別滴加稀釋濃度為1∶100的SYN和1∶200的PSD-95一抗4℃過夜;PBS替代一抗作陰性對照;生物素化二抗37℃孵育30 min;辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育30 min;DAB顯色劑避光染色10 min;每只大鼠隨機抽取5張切片，在海馬CA1區隨機抽取5個不相重疊的視野，顯微鏡(×400)下采用Image.Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統檢測出SYN的陽性產物數量和PSD-95的陽性細胞數及其各自平均光密度。

1.2.4 RT-PCR①RNA的提取 每組各取5只大鼠，麻醉后斷頭，快速取出海馬組織，TRIzol法提取總RNA;使用紫外分光光度計測定其在260 nm和280 nm波長的光吸收值，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。②逆轉錄反應:按試劑盒說明合成cDNA。③PCR擴增:β-actin上游引物:5'-GGT ATG GGT CAG AAG GAC TCC-3'，下游引物:5'-TGA TCT TCA TGG TGC TAG GAG CC-3'，擴增片段長度857 bp。SYN上游引物:5'-AAC AAA GGG CCT ATG ATG GA-3'，下游引物:5'-CCA GGT TCA GGA AGC CAA-3'，擴增片段長度232 bp。PSD-95上游引物:5'-GCC CTG TTT GAT TAC GAC AA-3'，下游引物5'-CTC ATA GCT CAG AAC CGA GT-3'，擴增片段長度250 bp。反應條件:94℃預變性 4 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30個反應循環，結束72℃充分延伸5 min。④產物測定:1.2%的瓊脂糖凝膠，取RT-PCR產物6 μl上樣電泳，150 v，45 min。紫外線透射儀觀察并拍照。以SYN/β-actin、PSD-95/β-actin表示產物的相對含量。

2 結果

2.1 甲苯胺藍尼氏染色 對照組大鼠海馬CA1區錐體層神經元數目和形態未見明顯改變，細胞呈錐形，排列規則，界限清晰;模型組大鼠海馬CA1區錐體層神經元數目較對照組明顯減少，細胞呈不規則形，細胞界限不清，間隙增大，胞內尼氏體減少;治療組大鼠海馬CA1區錐體層神經元損傷程度較模型組輕，胞內尼氏體也較模型組增加。見圖1。

2.2 SYN免疫組織化學染色 對照組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性產物呈顆粒狀分布，染色深且分布均勻;模型組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性產物染色淺，數目少且分布不均勻，與對照組相比，模型組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性產物數量明顯減少(P＜0.01)，平均光密度明顯降低(P＜0.01);治療組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性產物染色較深，數目較多，與模型組相比，治療組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性產物數量明顯增多(P＜0.01)，平均光密度明顯增強(P＜0.01)。見表1，圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區錐體層神經元(甲苯胺藍尼染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬CA1區分子層SYN陽性細胞(免疫組織化學染色，×400)

表1 各組大鼠海馬CA1區SYN表達(± s，n=5)

表1 各組大鼠海馬CA1區SYN表達(± s，n=5)

與對照組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 陽性產物數 平均光密度對照組232.4±15.79 0.210 9±0.009 8模型組 121.1±12.281) 0.142 8±0.014 41)治療組 190.7±19.551)2) 0.183 5±0.008 21)2)

2.3 PSD-95免疫組織化學染色 對照組大鼠海馬CA1區錐體層PSD-95陽性細胞分布較密集，呈錐形，可見軸突和樹突樣突起;模型組大鼠海馬CA1區錐體層PSD-95陽性細胞數和平均光密度明顯低于對照組(P＜0.01);治療組大鼠海馬CA1區錐體層PSD-95陽性細胞數和平均光密度明顯高于模型組(P＜0.01)。見表2，圖3。

表2 各組大鼠海馬CA1區PSD-95表達(± s，n=5)

表2 各組大鼠海馬CA1區PSD-95表達(± s，n=5)

組別 陽性細胞數 平均光密度對照組34.60±2.650 0.288 3±0.016 7模型組 21.74±2.6331) 0.234 4±0.018 41)治療組 30.64±3.6181)2) 0.259 5±0.016 31)2)

2.4 SYN和PSD-95mRNA的表達 RT-PCR和凝膠電泳顯示，在232 bp片段大小位置可見SYN mRNA陽性條帶，在250 bp片段大小位置可見PSD-95 mRNA陽性條帶。模型組大鼠海馬組織SYN和PSD-95 mRNA相對含量明顯低于對照組(P＜0.01)，治療組大鼠海馬組織SYN和PSD-95 mRNA相對含量明顯高于模型組(P＜0.01)。見表3，圖4，圖5。

圖3 各組大鼠海馬CA1區錐體層PSD-95陽性細胞(免疫組織化學染色，×400)

表3 各組大鼠海馬SYN和PSD-95 mRNA的表達水平(± s，n=5)

表3 各組大鼠海馬SYN和PSD-95 mRNA的表達水平(± s，n=5)

組別SYN mRNA PSD-95 mRNA對照組0.564 3±0.037 8 0.748 7±0.041 2模型組 0.257 9±0.009 91) 0.352 7±0.025 91)治療組 0.458 5±0.0251)2) 0.655 5±0.021 51)2)

圖4 各組大鼠海馬組織SYN RT-PCR結果

圖5 各組大鼠海馬組織PSD-95 RT-PCR結果

3 討論

有研究證實CCI中星形膠質細胞增生并活化，活化的星形膠質細胞的在缺血損傷后可分泌大量的細胞因子等炎性介質，參與CCI所致的腦損傷〔4〕。Farkas等〔5〕研究表明腦缺血后還可激活小膠質細胞。激活的小膠質細胞誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶-2的表達增加，導致其誘導產物一氧化氮、前列腺素E2大量合成〔6〕。激活的神經膠質細胞分泌的免疫炎性介質，反過來又可進一步激活神經膠質細胞，從而形成正反饋環路，促成CCI腦內慢性免疫炎癥反應的形成和炎性產物的持續升高，導致神經元變性、損傷和死亡〔7〕。我實驗室同期實驗證實了CCI后神經膠質細胞增殖并激活。本實驗表明本實驗室制作的CCI模型大鼠模擬了神經元損傷、神經膠質細胞增生等病理改變。

SYN參與神經遞質釋放和突觸囊泡循環，與突觸的重建及認知過程密切相關〔2〕。Schmitt等〔8〕研究SYN表達水平變化與學習記憶之間的關系，結果顯示海馬部神經元缺血后變性壞死，SYN陽性產物表達明顯減少，大鼠學習和記憶能力均下降。王冰等〔9〕利用2-VO法建立血管性癡呆模型小鼠，發現海馬區PSD-95免疫陽性產物減少。本實驗結果與上述文獻報道一致。CCI后SYN和PSD-95表達減少的原因可能有:①CCI所致的免疫炎癥反應引起神經元變性死亡，而后者可導致突觸的丟失;②CCI后受損神經元的代謝活動減弱和蛋白質的合成能力下降;③CCI所致的免疫炎癥反應直接損害突觸可塑性〔10〕。

雷公藤內酯醇能夠減少炎癥因子的表達，具有明顯的抗炎和神經保護作用，能促進突觸功能以及促進髓鞘形成，還能改善記憶和認知功能〔11〕。本實驗提示雷公藤內酯醇可能通過抑制CCI引起的免疫炎癥反應，促進大鼠海馬神經元SYN和PSD-95的表達，對突觸的可塑性起到一定的保護作用。

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8 Schmitt U，Tanimoto N，Seeliger M，et al.Detection of behavioral alterations and learning deficits in mice lacking synaptophysin〔J〕.Neuroscience，2009;162(2):234-43.

9 王 冰，王 佩，康 軍，等.血管性癡呆小鼠海馬突觸后致密物95表達的研究〔J〕.腦與神經疾病雜志，2007;15(4):258-69.

10 Min SS，Quan HY，Ma J，et al.Chronic brain inflammation impairs two forms of long-term potentiation in the rat hippocampal CA1 area〔J〕.Neurosci Lett，2009;456(1):20-4.

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