衰老相關蛋白prelamin A與MT－2A的相互作用

熊興東 劉振杰 王君文 周中軍 劉新光 (廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 5808)

早老癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome，HGPS)是一種由LMNA基因突變引起的核纖層蛋白病〔1〕。在HGPS患者中，由于核纖層蛋白A(LMNA)基因在其外顯子11的1 824位發(fā)生核苷酸替代(C→T)，盡管未造成氨基酸殘基的改變(G608G)，但產生了一個潛在的剪切位點，導致外顯子11的150nt被剪切，使得prelamin A的C末端50個氨基酸殘基被切除〔2〕。缺失的50個氨基酸殘基中包含一個內切蛋白酶Zmpste24的剪切位點。Zmpste24是一種金屬蛋白酶，是在哺乳動物組織中廣泛存在的多跨膜蛋白。Pendas等〔3〕在國際上首次制備Zmpste24缺失基因小鼠(Zmpste24-/-)，發(fā)現Zmpste24缺失的小鼠prelamin A加工成熟過程被阻斷，導致大量未加工的prelamin A堆積，而且Zmpste24-/-小鼠具有HGPS患者所表現出的很多典型性的早衰表型，如骨質疏松、生長延緩、脂肪營養(yǎng)不良、脫發(fā)、出牙異常和早老性死亡。這提示異常堆積的prelamin A會引起早衰。最近研究還發(fā)現，正常人細胞也存在這種prelamin A堆積的現象，只是處于低水平的狀態(tài)，隨著年齡增加而呈現逐漸增多的趨勢，提示早老癥與生理性衰老有著共同的細胞分子基礎〔4，5〕。細胞衰老本身是多因素的綜合結果，無論是何種途徑引起prelamin A的堆積，對細胞衰老的影響都可能通過其相互作用蛋白來實現。因此，尋找與衰老相關的prelamin A結合蛋白并對其生物學功能進行研究對于探索衰老發(fā)生的機制顯得非常有必要。本課題組采用酵母雙雜交方法從人骨骼肌DNA文庫中篩選prelamin A相互作用蛋白，初步發(fā)現金屬硫蛋白MT-2A能與prelamin A結合。為了進一步確證該蛋白質與prelamin A的體內外的相互作用，我們采用一對一的回復性驗證、細胞內共定位等方法進行了實驗，并初步探討金屬硫蛋白MT-2A與細胞早老的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 含有prelamin A全長的酵母表達質粒pG-BKT7-prelamin A、prelamin A與紅色熒光蛋白RFP融合表達載體pDsRed-prelamin A由廣東醫(yī)學院衰老研究所構建。大腸桿菌DH5α、質粒載體pEGFP-N1由廣東醫(yī)學院衰老研究所保存。酵母AH109購自 Clontech公司。HEK-293細胞和 HEK-293prelamin A細胞(表達不能被加工處理的prelamin A，細胞呈早老表型)由香港大學周中軍博士惠贈〔6〕。Lipofectamine2000為Invitrogen公司產品，其他為國產分析純試劑。

1.2 pACT2-MT-2A質粒的提取和純化 以A型核纖層蛋白前體prelamin A為誘餌蛋白進行酵母雙雜交篩選人骨骼肌文庫獲得了含有pACT2-MT-2A質粒的酵母，采用Hoffman裂解法〔7〕提取質粒 DNA。

收集5 ml培養(yǎng)物中的酵母沉淀，加入0.2 ml酵母裂解液(pH 8.0 Tris-HCl100 mmol/L，EDTA 1.0 mmol/L，2%Triton-X-100，1%SDS)，0.2 ml酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和 0.3 g 酸洗玻璃珠，劇烈振蕩2 min，離心后上清中的質粒DNA用2.5倍體積無水乙醇沉淀，最后將DNA沉淀重懸于20 μl無菌的TE緩沖液中。

提取的質粒DNA電擊轉化感受態(tài)DH5α，在含有Amp的平板上長出的克隆為含有單一pACT2-MT-2A質粒的克隆，送上海生工生物工程公司測序，測序引物為pACT2載體上的通用引物。

1.3 酵母一對一回復性驗證 純化的pACT2-MT-2A質粒電擊轉化含有pGBKT7-prelamin A的AH109酵母感受態(tài)，轉化混合物涂布于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His四缺平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，經β-半乳糖苷酶分析，觀察克隆是否顯示藍色。

1.4 重組載體pEGFP-MT-2A的構建 以HEK-293的cDNA為模板擴增得到的MT-2A PCR產物經雙酶切和膠回收純化，與同樣雙酶切和膠回收純化的載體pEGFP-N1連接，轉化感受態(tài)DH5α，挑取重組轉化子進行酶切和測序鑒定，得到重組質粒pEGFP-MT-2A。

1.5 質粒轉染HEK-293細胞和激光共聚焦顯微觀察 按4×104/孔密度接種HEK-293細胞至24孔板，板內預先放置蓋玻片，培養(yǎng)24 h后玻片上細胞生長至約70%匯合度，按Lipofectamine2000操作說明進行細胞轉染。

0.4 μg重組質粒pEGFP-MT-2A和0.4 μg pDsRed-LA 共轉染，培養(yǎng)48 h后取出玻片利用Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照。

1.6 RT-PCR 分別以HEK-293和HEK-293prelamin A細胞的cDNA為模板進行PCR擴增，檢測MT-2A基因的mRNA表達水平。MT-2A的RT-PCR擴增引物，MT-2A-F:CCGGAATTCATGGATCCCAACTGCTCCT;MT-2A-R:CCGCTCGAGTCA GGCGCAGCAGCTGCAC。β-actin的 RT-PCR 擴增引物，β-actin-F:GCACTCTTCCAGCCTTCCTTC;β-actin-R:CTGTCACCTTCACCGTTCCA。

PCR按照標準反應體系進行，反應條件如下:預變性:94℃2 min;變性:94℃ 30 s;退火:55℃ 30 s;延伸:72℃ 1 min，進行28個循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸5 min。在RT-PCR反應體系中，同一模板中同時加入目的基因引物和內標基因β-actin引物，比較兩者擴增產物濃度。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。

通過Alpha Imager 2200凝膠成像儀灰度掃描后，使用AlphaEaseFC3.1.2軟件分析結果，采用Studentt統(tǒng)計MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細胞中的差異表達。

2 結果

2.1 MT-2A與prelamin A回復性驗證的結果 將pACT2-MT-2A質粒轉化含有pGBKT7-prelamin A的AH109酵母感受態(tài)，在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His四缺平板上能夠生長出正常的克隆，經β-半乳糖苷酶分析顯示藍色(圖1)，證明MT-2A與prelamin A能夠在酵母細胞內特異性相互作用。

2.2 MT-2A和prelamin A蛋白在細胞內共定位 質粒pEGFP-MT-2A和pDsRed-prelamin A分別帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽，各取0.4 μg質粒共轉染HEK-293細胞后兩種熒光標簽蛋白分別與MT-2A和prelamin A融合表達。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現prelamin A(紅色熒光)主要位于核膜，環(huán)狀分布于核周圍;MT-2A(綠色熒光)同樣分布于核膜的周圍。MT-2A和prelamin A蛋白存在部分共定位 (黃色熒光，圖2)。

2.3 MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細胞中的表達差異 利用RT-PCR分析MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細胞中的表達差異，用AlphaEaseFC3.1.2軟件對各電泳片段進行光密度掃描分析。圖3結果表明金屬硫蛋白MT-2A在早老表型的HEK-293prelamin A細胞中的表達量顯著低于HEK-293細胞(P＜0.01)。

圖1 MT-2A與prelamin A在酵母體內的相互作用

圖2 MT-2A和prelamin A蛋白在HEK-293細胞內共定位分析

圖3 RT-PCR分析MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細胞中的差異表達

3 討論

隨著我國人口老齡化的到來，有關衰老的研究顯得非常必要。細胞衰老是個復雜而漸進的過程。它是指細胞在外在微環(huán)境變化或內在特定基因表達與失活等因素作用下脫離細胞周期，并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定狀態(tài)〔8〕。對兒童早老癥(HGPS)的研究結果表明，prelamin A能否正常加工成熟與細胞正常衰老或者早老密切相關〔2～5〕。若prelamin A正常加工受阻，大量未加工的prelamin A堆積，會導致DNA損傷顯著增加，并且存在明顯的DNA修復缺陷，細胞基因組不穩(wěn)定和p53介導的信號途徑被激活，最終導致細胞具有HGPS患者所表現出的早衰表型〔9〕，可見prelamin A的異常堆積與細胞衰老緊密相關。但無論是何種途徑引起prelamin A的堆積，對細胞衰老的影響都可能通過其相互作用蛋白來實現。

我們利用酵母雙雜交方法從人骨骼肌DNA文庫中篩選prelamin A結合蛋白，結果篩選到了一組相互作用蛋白，其中包括MT-2A。一對一回復性驗證實驗證明MT-2A與prelamin A在酵母體內相互作用。熒光共定位的結果也表明MT-2A與prelamin A在細胞內相互作用。進一步研究發(fā)現，與正常表型的HEK-293細胞相比，MT-2A在早老表型的HEK-293prelamin A細胞中顯著低表達，提示MT-2A與細胞早老密切相關。此外，由于HGPS患者中LMNA基因突變主要集中在prelamin A蛋白的C末端，我們課題組采用酵母雙雜交方法從人骨骼肌細胞cDNA文庫中篩選prelamin A的C端特異性結合蛋白，結果也發(fā)現MT-2A與prelamin A的C端特異性結合(另文發(fā)表)。

金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于生物細胞內的低分子質量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白。研究表明MT不僅具有重金屬解毒，清除自由基，抗輻射，修復組織損傷以及調節(jié)微量元素等重要作用，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥密切相關〔10～13〕。哺乳動物的MT根據等電點和氨基酸組成的不同可分為4種亞型，即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。人MT-2A富含巰基，由61個氨基酸殘基組成，其中有20個半胱氨酸。研究發(fā)現MT-2A在多種惡性腫瘤或者低分化的腫瘤中高表達，提示MT-2A與細胞的惡性增殖密切相關〔14〕。目前有關MT-2A與細胞衰老的研究尚未見報道。而我們的結果表明，MT-2A可能作為一個新的prelamin A相互作用蛋白，參與細胞早老的發(fā)生。但其影響細胞衰老的具體分子機制仍有待深入研究。

1 Liu B，Zhou Z.Lamin A/C，laminopathies and premature ageing〔J〕.Histol Histopath，2008;23(6):747-63.

2 Eriksson M，Brown WT，Gordon LB，et al.Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome〔J〕.Nature，2003;423(6937):293-8.

3 Pendas AM，Zhou Z，Cadinanos J，et al.Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice〔J〕.Nat Genet，2002;(31):94-9.

4 Scaffidi P，Misteli T.Lamin A-dependent nuclear defects in human aging〔J〕.Science，2006;312(5776):1059-63.

5 Ragnauth CD，Warren DT，Liu Y，et al.Prelamin A acts to accelerate smooth muscle cell senescence and is a novel biomarker of human vascular aging〔J〕.Circulation，2010;121(20):2200-10.

6 Krishnan V，Chow MZ，Wang Z，et al.Histone H4 lysine 16 hypoacetylation is associated with defective DNA repair and premature senescence in Zmpste24-deficient mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011;108(30):12325-30.

7 Hoffman CS，Winston F.A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli〔J〕.Gene，1987;57(2-3):267-72.

8 Campisi J，Yaswen P.Aging and cancer cell biology〔J〕.Aging cell，2009;8(3):221-5.

9 Varela I，Cadinanos J，Pendas AM，et al.Accelerated ageing in mice deficient in Zmpste24 protease is linked to p53 signalling activation〔J〕.Nature，2005;437(7058):564-8.

10 Yamasaki M，Nomura T，Sato F，et al.Metallothionein is up-regulated under hypoxia and promotes the survival of human prostate cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2007;18(5):1145-53.

11 Kwon CS，Kountouri AM，Mayer C，et al.Mononuclear cell metallothionein mRNA levels in human subjects with poor zinc nutrition〔J〕.Brit J Nutri，2007;97(2):247-54.

12 Kim HG，Kim JY，Han EH，et al.Metallothionein-2A overexpression increases the expression of matrix metalloproteinase-9 and invasion of breast cancer cells〔J〕.FEBS Lett，2011;585(2):421-8.

13 Reinecke F，Levanets O，Olivier Y，et al.Metallothionein isoform 2A expression is inducible and protects against ROS-mediated cell death in rotenone-treated HeLa cells〔J〕.Biochem J，2006;395(2):405-15.

14 Jin R，Chow VT，Tan PH，et al.Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer〔J〕.Carcinogenesis，2002;23(1):81-6.