骨髓間充質干細胞移植對大鼠血管成形術后內膜增生及炎癥因子表達的影響

束 波 范 芳 (遵義醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴州 遵義 563003)

再狹窄是經皮腔內冠脈介入術(PCI)術后的主要并發癥，目前發生機制仍不明確。現有的研究表明再狹窄的發生主要與局部的炎癥反應、內皮功能下降等有關，其中血管炎癥反應也起了十分重要的作用〔1〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多項分化潛能，經過血管內皮生長因子等因子的誘導，可以分化為內皮細胞;此外，與成熟內皮細胞共培養可以促進其向內皮方向分化，并部分抑制平滑肌細胞的增殖。BMSCs還具有獨特的免疫學特性，參與多種免疫細胞功能的調節〔2〕。研究表明BMSCs這一作用與調節IL-10等相關炎性細胞因子的表達有關〔3〕。由此推測BMSCs移植對血管損傷后的炎癥反應可能具有一定的調節作用。本研究擬觀察移植BMSCs對損傷血管炎癥因子表達及新生內膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 L-DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司，美國);DAPI(Sigma公司，美國);Percoll分離液(Pharmacia公司，美國);核轉錄因子-κBp65(NF-κBp65)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及增殖細胞核抗原(PCNA)一抗(武漢博士德公司);通用型免疫組化二抗試劑盒，ELISA檢測試劑盒，FITC標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。2F球囊導管(Cordis公司，美國)。圖像分析系統(Leica Qwin Plus公司，德國)。倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實驗動物與分組 雄性SD大鼠48只，2～3個月齡，體重質量200～300 g。大鼠右側頸總動脈行球囊損傷后隨機分為BMSCs組(n=24)和模型組(n=24)，BMSCs組接受BMSCs經尾靜脈移植，對照組接受等量的PBS液注射。

1.3 BMSCs的培養、鑒定及標記 無菌條件下分離大鼠股骨，PBS液沖洗后獲取新鮮骨髓液，通過密度梯度離心法分離出其中的單個核細胞，接種于含體積分數10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml的L-DMEM完全培養液中，置于37℃，體積分數5%CO2孵育箱中培養。原代培養2 d后首次換液，以后每2～3 d換培養液，BMSCs增殖到80% ～90%時傳代。移植前用DAPI(50 mg/L)對BMSCs進行標記，置于37℃孵育箱中孵育30 min，再用PBS洗4～5次除去結合的DAPI。

1.4 頸總動脈球囊損傷模型的制備及細胞的移植 大鼠麻醉后分離右側頸內、外動脈和頸總動脈。送入2F球囊至頸總動脈，生理鹽水充盈球囊后緩慢拖動，持續1 min，間歇1 min后重復，共3次，使頸總動脈損傷長度大約2～3 cm，退出球囊，結扎頸外動脈，恢復前向血流。然后將事先已標記好的BMSCs 5×106/ml的總量通過頸外動脈注入損傷血管局部，對照組注入同等體積PBS，孵育30 min后恢復血流。

1.5 移植組血管內膜BMSCs歸巢的檢測 術后7 d取BMSCs組頸動脈，PBS反復沖洗后將血管縱向切開，平鋪在載玻片上，置入4%多聚甲醛中固定30 min，鋪上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察血管內膜DAPI陽性標記的BMSCs的歸巢。

1.6 ELISA法檢測血清TNF-α和IL-10濃度 術后7、14、28 d采血室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min分離血清，根據ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-10的濃度。

1.7 免疫組化染色檢測NF-κBp65、α-SAM及PCNA表達 術后14 d，留取部分損傷和正常血管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋等處理后橫斷面切片5 μm，利用SABC法進行NF-κBp65、α-SMA、PCNA免疫組化染色。采集圖像后，通過圖像分析軟件計算積分光密度值分析NF-κBp65、α-SAM水平;計數新生內膜、中膜的陽性細胞數和細胞總數，分別取其平均數，以陽性細胞數除以細胞總數為該部位PCNA的陽性率。

1.8 蘇木素-伊紅(HE)染色分析 術后28 d處死動物，留取部分損傷和正常血管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋等處理后橫斷面切片5 μm，進行常規HE染色。采集圖像后通過計算機病理圖像分析系統測定新生內膜面積、中膜面積及新生內膜面積/中膜面積。

1.9 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，定量資料以±s表示，組間比較采用成組資料的t檢驗，組內比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 BMSCs的培養及標記 培養的第三代BMSCs呈現梭形、網狀貼壁排列生長。DAPI標記后細胞核發藍光，標記率達100%。見圖1。

2.2 BMSCs歸巢的檢測 術后7 d，BMSCs移植組血管內膜可見DAPI-BMSCs的細胞核發藍色熒光。見圖2。

2.3 NF-κBp65、PCNA及α-SMA的免疫組化分析 與對照組相比，術后14 d BMSCs組新生內膜和(或)中膜中NF-κBp65(0.32± 0.02 vs 0.19±0.01，P＜0.05)、α-SMA(0.64± 0.06 vs 0.32±0.04，P＜0.01)的平均吸光度值明顯降低;BMSCs組的PCNA陽性細胞率亦較對照組明顯降低〔(55.46±2.6)%vs(25.41±2.2)%，P＜0.05〕。見圖3。

圖1 BMSCs的培養和標記(×100)

圖2 DAPI標記的BMSCs歸巢至血管內膜(×400)

2.4 血清TNF-α 和 IL-10濃度變化 術后7、14、28 d，BMSCs組血清TNF-α濃度均較對照組明顯降低(P＜0.01)，而血清IL-10的濃度對照組顯著升高(P＜0.01)。見表1，表2。

表1 不同時間點各組血漿中TNF-α的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

表1 不同時間點各組血漿中TNF-α的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

與同一時間點的對照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 術前 術后7 d 術后14 d 術后28 d對照組 32.35±4.63 75.21±5.62 62.07±3.54 46.73±4.68 BMSCs組 34.68±5.38 66.48±4.581)48.60±3.131)40.59±4.471)

表2 不同時間點各組血漿中IL-10的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

表2 不同時間點各組血漿中IL-10的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

組別 術前 術后7 d 術后14 d 術后28 d組別 術前 術后7 d 術后14 d 術后28 d對照組 34.43±4.76 45.21±6.85 37.07±5.82 27.73±3.78 BMSCs組 36.57±6.34 67.48±4.871) 50.60±6.331) 40.76±5.481)

2.5 血管形態學分析 術后28 d，對側未損傷血管內彈力板完整，血管內膜可見單層內皮細胞，無新生內膜增生;對照組內彈力板斷裂，新生內膜明顯增生，增生平滑肌細胞排列紊亂。BMSCs組新生內膜增生較對照組明顯減輕，新生內膜面積、新生內膜面積/中膜面積均顯著低于對照組。見圖4。

圖3 NF-κBp65、PCNA及α-SMA的免疫組化染色(×200)

圖4 各組血管形態學分析(×100)

表3 BMSCs移植后28 d對血管新生內膜增生的影響(± s，n=8)

表3 BMSCs移植后28 d對血管新生內膜增生的影響(± s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 內膜面積(mm2) 中膜面積(mm2) 內膜/中膜(%)對照組0.284±0.023 0.124±0.011 2.290±0.212 BMSCs組 0.104±0.0271) 0.132±0.012 0.787±0.0921)

3 討論

PCI是目前冠心病治療的重要方法。急診PCI的動物模型顯示其體內釋放的大量細胞因子、炎性反應物及血管平滑肌的增殖和遷移是血管再狹窄發生的重要原因〔4〕。再狹窄嚴重影響遠期預后，因此，如何有效抑制血管炎癥反應并減輕血管成形術后再狹窄程度具有重要意義。

BMSCs是來源于骨髓的成體干細胞。研究證實BMSCs具有多向分化潛能，可分化為內皮細胞、心肌細胞等〔5〕;BMSCs還具有旁分泌作用，分泌多種生長因子參與損傷組織修復〔6〕;此外，BMSCs具有強大的免疫調節功能，免疫原性低〔7〕，還有獨特的免疫抑制特性，可以抑制淋巴細胞增殖和抗原呈遞細胞的活化與成熟。體外研究發現，用來源于BMSCs的培養液能改善MCP-1導致的心肌細胞損傷;移植BMSCs到大鼠病毒性心肌組織，可抑制趨化因子的表達和炎性細胞在心肌的局部浸潤〔8〕。另有研究發現，BMSCs移植后降低了梗死心肌局部TNF-α、IL-1表達，改善心臟功能〔9〕。以上均說明 BMSCs可參與免疫及炎癥疾病的治療。

NF-κB是機體調控細胞基因轉錄的關鍵因子之一，在參與機體防御功能及炎癥反應中發揮重要作用。p50/p52和p65亞單位是NF-κB的活性形式。NF-κBp65進入細胞核后啟動基因轉錄，可上調TNF-α、IL-10等炎癥因子表達〔10〕。這些炎癥因子可介導白細胞與內皮間的黏附反應，使白細胞浸潤到損傷血管壁引起血管炎癥。TNF-α、CRP等炎癥因子與支架置入后血管再狹窄發生密切相關〔11〕。Wang 等〔12〕發現血管損傷后 NF-κB表達與新生內膜增生呈正相關，表明NF-κB激活引起的炎癥反應導致內膜增生。本研究也發現，球囊損傷大鼠頸總動脈14 d后對照組新生內膜有NF-κBp65表達，并伴PCNA和α-SMA的表達明顯增加，血漿 TNF-α濃度升高。由此可見，血管 NF-κBp65的激活調節了TNF-α濃度升高，參與了血管損傷后的炎癥反應及新生內膜的增生。

新近的研究發現，BMSCs能分泌TSG-6(TNF-α stimulated gene/protein 6)，抑制NF-κB激活，進而抑制下游炎癥因子的表達〔13，14〕。此外，TSG-6還能作用于巨噬細胞分泌抗炎癥因子IL-10〔15〕。Dhingra 等〔16〕發現 IL-10 可通過抑制 NF-κB 活性，進而下調TNF-α的表達。本研究結果表明，BMSCs移植可能通過升高IL-10的表達并下調損傷血管局部NF-κBp65表達，進而抑制下游炎癥因子表達，從而減輕損傷血管炎癥反應和新生內膜的增生。

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