定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床研究

王雪英

鼻咽癌(NPC)在我國的發病率較高，多發于我國南方。而Espstein-barr病毒屬于皰疹病毒科?亞科，已有研究發現EB病毒與鼻咽癌發病密切相關[1],鼻咽癌患者EB病毒感染率明顯高于健康人群。過去常常利用檢測EB病毒的相關抗體來對鼻咽癌患者實施診斷及對病情變化檢測，但這種方法特異性和敏感性較差。隨著PCR技術的不斷發展，使直接對EBV定量檢測在臨床中得以實現，且已被廣泛使用。因此，本研究為探討定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床意義，現將具體情況報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月～2011年12月在經我院病理檢查初診為鼻咽癌患者320例，其中男180例，女140例；年齡最大71歲，最小24歲，平均44.2歲；病理類型：泡狀核癌30例，中分化鱗癌75例，低分化鱗癌215例。健康體檢者290例,男155例,女135例,平均年齡39.4(26～63)。標本采集:分別抽取3組受檢者外周血2ml,加入EDTA抗凝管,4000r／min離心,然后吸取上層血漿于-20℃保存待測。

1.2 研究方法 采用熒光定量PCR法血漿檢測EBVDNA含量。實時熒光定量PCR儀為德國Roche公司生產的LightCyclerⅡ,標本嚴格按中山大學達安基因股份有限公司生產的EB病毒(EBV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒說明書進行操作,熒光定量PCR反應體系包括：PCR緩沖50μl，上下游引物和探針各10pmol，dNTP、dCTP、dGTP、dUrP各200pmol／L,Taq聚合酶5μl模板5μl。雙標記熒光探針序列5′-(FAM)CTGTCT GTAAAGTCCAGCCTCC(TAMRA)-3′,每批PCR均用雙蒸水作陰性對照；克隆合成的EB病毒DNA片段作為陽性對照，并稀釋成不同濃度梯度進行PCR擴增。先將熒光定量PCR擴增儀在93℃3min預變性，然后接93℃45s，55℃2min，40個循環，反應結束，用計算機將樣本和標準曲線對比計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包對所有數據進行處理，用χ2檢驗比較計數資料，以均數±標準差（x±s）表示評分數據，采用t檢驗對計量資料進行組間顯著性測試，將P≤0.05定為檢驗水準。

2 結果

2.1 3組EBV-DNA測定結果及其比較 治療前組陽性率為92.5%,治療后組均經隨訪鼻內鏡活檢和病理證實為NPC放療后復發陽性率為23.4%；健康對照組陽性率為3.4%；3組間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）具體結果見下表1。

表1 對照組和治療前后組血漿EVB-DNA檢測結果比較

2.2 血漿EBV-DNA水平和鼻咽癌嚴重程度的關系 在經我院病理診斷為鼻咽癌的320例患者中，有淋巴轉移的201例，無淋巴轉移119例，在有無淋巴結轉移組間比較，血漿EVB-DNA檢測陽性率差異具有統計學意義（P＜0.05）。具體結果見下表2。

表2 鼻咽癌有無淋巴結轉移組間檢測結果比較

3 討論

EB病毒是嗜淋巴細胞的皰疹病毒,屬DNA腫瘤病毒,該種病毒能引起人類的傳染性單核細胞增多癥,還和T淋巴細胞瘤、類風濕性關節炎、鼻咽癌等有關,也可終身潛伏體內[2]。雖然不能直接肯定EB病毒就是導致鼻咽癌的病因,但大量科學研究已經發現,在幾乎所有的鼻咽癌細胞中存在EB病毒,在鼻咽癌細胞DNA中可以找到被整合的EBV特異性基因片段,說明EB病毒感染和鼻咽癌有密切關系。目前，臨床上鼻咽癌患者治療前診斷、療效監測、局部復發或轉移的診斷，主要依靠影像學檢查，但影像學檢查價格比較昂貴，且有時對療效判斷、診斷復發或轉移時敏感性較差。主要原因是因為一方面，CT、MRI等是一種局部顯像技術，不可能同時檢測到每一個可能發生轉移的部位；另一方面，傳統的影像學檢查在診斷較小的轉移處、放療后腫瘤浸潤與纖維化鑒別時，以及殘存腫瘤性質的判斷方面具有一定的局限性[3]。

隨著核酸分子雜交及PCR技術的發展,特別是熒光基因探針（FQ-PCR）技術在臨床的應用,為人們研究NPC的病因和診斷方法提供了新的手段。FQ-PCR技術具有高特異、高靈敏、有效防止污染的優點,用于檢測病原微生物感染比免疫學方法檢測抗原和抗體更直接、更準確[4]。EBV-DNA拷貝數是患者體內的EB病毒數量。若患者體內病毒拷貝數高,就預示著該患者病情較為嚴重[5-6]。本研究通過熒光PCR對鼻咽癌患者治療前后以及健康體檢者的血漿EBV-DNA含量進行定量檢測，發現治療前組患者血漿EBV-DNA陽性率為92.5%明顯高于治療后組（23.4%）和健康對照組（3.4%），P＜0.05。治療后組的陽性病例均出現鼻咽癌復發，陰性病例沒有復發。在有無淋巴轉移組間比較，有淋巴轉移組的血漿EBV-DNA陽性率明顯高于無淋巴轉移組（P＜0.05）。這說明鼻咽癌與EB病毒感染密切相關。

總而言之，血漿EBV-DNA水平對鼻咽癌的診斷具有重要意義，同時有可能成為監測鼻咽癌患者放療后復發、轉移的腫瘤標記物在鼻咽癌的治療中起重要作用。

[1]李多杰,彭開桂,江浩,等.血漿EBV-DNA定量分析在監測鼻咽癌患者復發和轉移中的價值[J].實用腫瘤雜志,2008,23(1):12-15.

[2]李群.EB病毒VCA2IgA和EA2IgA抗體與鼻咽癌診斷的關系[J].海南醫學院學報,2007,13(2):180.

[3]楊德輝.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA檢測的研究現狀[J].中山大學研究生學刊,2006,26(1):1-5.

[4]曾剛毅,唐孝亮,鐘海軍.實時熒光定量PCR法檢測鼻咽癌患者血漿游EB病毒DNA的臨床應用[J].檢驗醫學與臨床,2008,5(10):591.

[5]馮海燕,莫穎禧,周曉瑩,等.鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA水平與腫瘤的分期關系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外頸外科雜志,2008,22(5):277-278.

[6]熊春娥.鼻咽癌放療的治療及護理體會[J].當代醫學,2009,15(3):126-127.