轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)小鼠肝功能若干參數(shù)的影響

段妍慧，富麗娜，黃 毅，孫艷波，劉 金，顏亨梅

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生態(tài)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

國(guó)際上第一批轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物美國(guó)耐溴苯腈棉花和加拿大耐草丁膦油菜于1995年上市后，各國(guó)利用不同的抗除草劑基因培育了不同的抗除草劑作物。隨著轉(zhuǎn)基因作物的迅速發(fā)展，人們對(duì)其安全性的思考也逐漸加深。轉(zhuǎn)抗除草劑基因稻谷在農(nóng)業(yè)上給人類帶來較大的益處，但從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，還需要對(duì)其生物安全性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，以確保自然界平衡及人類食品安全。其中，針對(duì)轉(zhuǎn)Bar 基因稻谷，已有專家從群落和基因方面對(duì)其做出了分析評(píng)價(jià)，認(rèn)為該稻谷對(duì)細(xì)菌、昆蟲等在群落結(jié)構(gòu)上未產(chǎn)生明顯影響[1-3]，但作為人類的主食，轉(zhuǎn)Bar 基因稻谷的安全性還需要用與人類更為接近的哺乳動(dòng)物進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。與轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白稻谷不同，轉(zhuǎn)抗除草劑基因產(chǎn)物的靶目標(biāo)一般是人工合成的除草劑，自然界中極少存在于其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，許多試驗(yàn)中均證明抗除草劑基因?qū)ι矬w沒有急性毒性[4]。但由于轉(zhuǎn)基因植物中含有的轉(zhuǎn)基因量相對(duì)較少，且生物有一定的適應(yīng)性，因此短時(shí)間喂養(yǎng)[5-7]或者直接灌喂轉(zhuǎn)基因蛋白[8]的方法不能反映出轉(zhuǎn)基因植物對(duì)小鼠世代累積的影響。筆者通過喂養(yǎng)親本小鼠90 d，對(duì)其繁殖的F1、F2代小鼠進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件下轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)傳代小鼠肝功能的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試稻谷為轉(zhuǎn)基因抗除草劑恢復(fù)系Bar 68-1、雜交早稻組合香125S/Bar68-1 和對(duì)照香兩優(yōu)68（香125S/D68），由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供；供試哺乳動(dòng)物為SPF 級(jí)昆明小鼠，6 周齡大小的小鼠120 只，體重分布范圍18～20 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在保證小鼠正常生命活動(dòng)不受影響（主要考慮蛋白質(zhì)的攝入量）的情況下，配比小鼠食物的成分。按照GBl5193.1-2003《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》[9]規(guī)定，最高劑量組是不影響膳食平衡的最大添加量。選擇18～20 g 區(qū)間的昆明小鼠120 只，隨機(jī)平均分為6 組，其中3 組分別喂食含量為20%（A）、40%（B）、60%（C）的轉(zhuǎn)Bar 基因稻谷，另外3 組以同品系常規(guī)稻谷飼喂作為對(duì)照，分別喂食含量為20%（CKA）、40%（CKB）、60%（CKC）的常規(guī)基因稻谷。采取自由取食取水方式喂養(yǎng)，雌雄分籠喂養(yǎng)90 d。用相對(duì)應(yīng)組別親本小鼠合籠，產(chǎn)下F1代，飼養(yǎng)至性成熟后，隨機(jī)每組抽取5 只進(jìn)行檢測(cè)。同方法繁殖F2代，飼養(yǎng)至性成熟后，隨機(jī)每組抽取5 只進(jìn)行檢測(cè)。處死前12 h 禁食。

1.2.2 觀測(cè)內(nèi)容及測(cè)定指標(biāo) （1）觀察各組小鼠日常行為，記錄是否出現(xiàn)異常行為。（2）采樣及血生化指標(biāo)測(cè)定：隨機(jī)取每組小鼠，摘眼球采血，取1.5 mL 血于離心管中呈斜面放置30 min，4 500 g 離心15 min，制備血清。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，測(cè)定白/球比（A/G）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH-L）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）8項(xiàng)指標(biāo)。（3）肝臟器官指數(shù)測(cè)定：每組隨機(jī)抽取5 只空腹小鼠，抽血樣后，取肝臟拭去表面污血，用天平（10-4g）稱重。器官指數(shù)=器官重量/體重。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用數(shù)據(jù)軟件SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)傳代小鼠行為的影響

通過持續(xù)性觀察，每天按時(shí)跟蹤觀察和記錄兩代小鼠日常行為，尤其在下午13∶00～14∶00 時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行仔細(xì)觀察，兩代小鼠均未發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象。每天分別在早上8∶30～9∶00，晚上19∶30～20∶00 喂食后，觀察小鼠攝食、飲水情況，均積極攝食、飲水，并未發(fā)現(xiàn)精神不振，厭食等現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因組和常規(guī)對(duì)照組F1、F2兩代小鼠均未出現(xiàn)異常行為。因此，轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)傳代小鼠的日常行為未產(chǎn)生明顯影響。

2.2 對(duì)傳代小鼠肝功能的影響

2.2.1 小鼠肝臟器官指數(shù)測(cè)定 如表1 所示，與對(duì)照相比，F(xiàn)1、F2代A、B、C 3 個(gè)劑量組小鼠肝臟器官指數(shù)均無明顯差異（P>0.05）。

表1 供試小鼠肝臟器官指數(shù)測(cè)定

2.2.2 小鼠肝臟細(xì)胞生化指標(biāo)測(cè)定 如表2 所示，對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞損傷代謝能力生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，與對(duì)照相比，F(xiàn)1除B 組堿性磷酸酶出現(xiàn)顯著性差異（P=0.017<0.05）外，A、C 組的白/球比、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶等指標(biāo)均無顯著性差異（P>0.05）；F1代A、B、C 3 組的葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇3 項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異（P>0.05）。

對(duì)F2代小鼠肝臟細(xì)胞損傷代謝能力生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表3，與對(duì)照相比，F(xiàn)2代A、B、C 3 組的白/球比、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶5 項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異（P>0.05）；F2代A、B、C 3 組的葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇3 項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異（P>0.05）。

表2 F1 代供試小鼠肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

表3 F2 代供試小鼠生化指標(biāo)的測(cè)定

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行觀察，可以了解動(dòng)物的身體以及生活狀況。動(dòng)物的行為是個(gè)體與其內(nèi)外環(huán)境維持動(dòng)態(tài)平衡的重要表現(xiàn)形式。當(dāng)動(dòng)物受到外界刺激時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生某些異常行為。動(dòng)物的異常行為主要表現(xiàn)如下：以固定形式反復(fù)出現(xiàn)的行為，并沒有明確的生物學(xué)功能；嗜血；攻擊性加強(qiáng)；生殖方面失常，主要為性行為失常或缺乏母性。有資料報(bào)道，供試的昆明小鼠在下午13∶00～14∶00 是皮質(zhì)醇分泌高峰期，小鼠高度興奮，這也是異常行為發(fā)生較多的時(shí)間段。另外，小鼠的攝食、飲水情況，可以反映出小鼠身體狀況，當(dāng)小鼠身體產(chǎn)生病變時(shí)，小鼠會(huì)出現(xiàn)厭食、精神萎靡等現(xiàn)象。兩代小鼠在試驗(yàn)條件下均未發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象，由此可見，用轉(zhuǎn)Bar 基因稻谷喂養(yǎng)并未對(duì)小鼠日常行為產(chǎn)生明顯影響。

器官指數(shù)是指試驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比值。正常成年動(dòng)物的器官重量會(huì)隨著體重的增長(zhǎng)而增加，在不同時(shí)期各器官增重的幅度不同，但兩者之間的正相關(guān)性不會(huì)改變。動(dòng)物染毒后，受損臟器重量可以發(fā)生改變，故臟器系數(shù)也隨之而改變。動(dòng)物體發(fā)生病變時(shí)，物質(zhì)代謝得不到有效調(diào)節(jié)而不能正常進(jìn)行，血液中某些化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量就會(huì)發(fā)生改變。因此，人們一直將這一特性用于藥物安全評(píng)價(jià)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)及其他較長(zhǎng)時(shí)間觀察動(dòng)物臟器受影響與否的試驗(yàn)。肝臟作為“物質(zhì)代謝中樞”對(duì)全身物質(zhì)代謝和生理機(jī)能有著重大影響，肝臟功能受損對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。試驗(yàn)通過解剖觀察小鼠肝臟形態(tài)及結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)明顯硬化、腫大、萎縮等病理變化。結(jié)果表明：兩代轉(zhuǎn)基因組與常規(guī)對(duì)照組小鼠肝臟器官指數(shù)并無顯著性差異（P>0.05）。由此可見，轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)小鼠肝臟器官指數(shù)無明顯影響。

機(jī)體各組織細(xì)胞都有合成蛋白質(zhì)的能力，其中以肝細(xì)胞最強(qiáng)。肝臟除了合成本身所需要的各種蛋白質(zhì)外，還能合成大部分血漿蛋白。肝臟出現(xiàn)病理變化時(shí)，血漿蛋白尤其是白蛋白含量降低，同時(shí)肝病變的各種因素又刺激巨噬細(xì)胞系統(tǒng)合成球蛋白增多，故A/G 值下降。因此，通過A/G 值的比較，可以了解肝臟是否發(fā)生病變[10]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清中濃度，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使血清中該酶含量增高1 倍。因此，谷丙轉(zhuǎn)氨酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝臟細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，才能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度偏高。試驗(yàn)將2 種轉(zhuǎn)氨酶共同作為判斷肝臟病變的主要指標(biāo)，根據(jù)白/球比、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等主要肝功能細(xì)胞損傷生化指標(biāo)值來看，轉(zhuǎn)基因組和常規(guī)對(duì)照組的兩代小鼠中以上3 項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異。

堿性磷酸酶除存在于肝臟外，還廣泛分布于腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織中，是診斷骨病、黃疸肝炎等疾病的依據(jù)[11]。乳酸脫氫酶主要用于心肌梗塞、腫瘤、肝病等診斷[11]。在F1代B 組中，盡管與對(duì)照相比，堿性磷酸酶的差異達(dá)到了顯著水平，但是轉(zhuǎn)基因水稻組各組之間數(shù)值不存在明顯差異，常規(guī)對(duì)照組同樣也無明顯差異。這2 項(xiàng)指標(biāo)用于檢測(cè)的范圍甚廣，但與試驗(yàn)要檢測(cè)的生理生化指標(biāo)關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，因此筆者將其作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)小鼠肝功能影響的輔助指標(biāo)。堿性磷酸酶的變化與其他生理現(xiàn)象也有密切關(guān)系，出現(xiàn)差異可能是由其他生理活動(dòng)造成，這有待今后進(jìn)一步研究。

血清中血糖的濃度代表了肝的糖生成能力，血糖直接氧化供給動(dòng)物機(jī)體代謝活動(dòng)所需能量，血糖的含量變化是機(jī)體對(duì)糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的反應(yīng)。正常動(dòng)物的血糖水平一般相對(duì)穩(wěn)定。甘油三酯和膽固醇是血脂檢測(cè)中最重要的2 項(xiàng)指標(biāo)，其含量是衡量動(dòng)物健康的重要標(biāo)志。該試驗(yàn)結(jié)果表明，血糖、甘油三酯和總膽固醇各組間差異均不顯著。這表明與常規(guī)水稻飼喂相比，轉(zhuǎn)基因稻谷喂養(yǎng)小鼠對(duì)其肝臟代謝影響不顯著。

綜合了解轉(zhuǎn)基因稻谷是否會(huì)對(duì)小鼠造成影響，較單一的指標(biāo)更有參考價(jià)值。因此，在綜合考慮供試小鼠的日常行為、肝臟器官指數(shù)、肝臟細(xì)胞損傷生化指標(biāo)、肝臟代謝水平生化指標(biāo)等測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下，與非轉(zhuǎn)基因稻谷喂養(yǎng)小鼠相比，轉(zhuǎn)Bar 基因稻谷飼喂未發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠肝功能造成明顯的影響。

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